何道同 陳珺明 宋海燕 季 光 王 兵△

1.上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院中醫(yī)科 (上海，200233) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所

非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致的以肝細(xì)胞脂肪變性為主的臨床病理綜合征。目前認(rèn)為胰島素抵抗 (IR)在NAFLD發(fā)病中起關(guān)鍵作用，且貫穿疾病的始終。就臨床表現(xiàn)和體征而言，脂肪性肝病當(dāng)屬中醫(yī)“肥胖、痰飲、積聚、脅痛”等病的范疇，起因多為過(guò)食肥甘厚味、過(guò)度肥胖，或感受濕熱毒邪，或情志失調(diào)，或久病體虛。其發(fā)病機(jī)制，眾多學(xué)者認(rèn)為是肝失疏泄，脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)結(jié)，痰濁郁結(jié)，瘀血阻滯，而致痰濕瘀阻互結(jié)，痹阻肝臟脈絡(luò)而形成脂肪性肝病。本病病位在肝，與脾關(guān)系密切，肝郁脾虛是脂肪肝的主要病理基礎(chǔ)，痰、濕、瘀、熱是脂肪肝的主要表現(xiàn)形式。本研究以高脂高糖飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察柴胡人參藥對(duì)對(duì)其糖、脂代謝，肝臟病理變化及胰島素抵抗和瘦素的影響，探討柴胡人參藥對(duì)防治脂肪性肝病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠44只，體質(zhì)量 (130±15)g，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) ［SCXK(滬)2007-0005］，自由進(jìn)食飲水，12小時(shí)明暗周期，適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物與試劑 柴胡人參藥對(duì):應(yīng)用柴胡配伍人參 (4∶2)，采用中藥超微飲片，柴胡4g相當(dāng)于生藥用量20g，人參2g相當(dāng)于生藥用量10g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。給藥方法:中藥超微飲片柴胡-人參，3g·kg－1·d－1灌胃，1次/d，連續(xù)4周。羅格列酮片，葛蘭素史克 (天津)有限公司，批號(hào):H20020475，給藥方法:羅格列酮，0.4g·kg－1·d－1灌胃，1次/d。7170全自動(dòng)生化分析儀;碘125I胰島素放射免疫分析藥盒;瘦素放射免疫分析藥盒。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的建立 44只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組大鼠 (C)10只、另34只進(jìn)行造模，C組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)，造模大鼠予以高脂高糖飼料 (68%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+15%蔗糖+2%膽固醇)喂養(yǎng)，以上飼料均由中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。于第2、4、6、8周末各處死1只造模大鼠，做肝臟病理HE染色，判斷造模情況。造模8周后，將造模成功大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組 (M，n=10)、羅格列酮組 (R，n=10)和柴胡人參藥對(duì)組 (Y，n=10)。

1.2.2 給藥方法 Y組和R組大鼠分別以柴胡人參藥對(duì)和羅格列酮灌胃，M組和C組大鼠均以等量生理鹽水灌胃。除C組外其余3組大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料飲食，C組大鼠給予普通飼料。用藥4周后殺鼠取材。

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察大鼠食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)及動(dòng)物死亡情況;稱量體重;觀察肝臟的形態(tài)，包括重量、外形、色澤、質(zhì)地;計(jì)算肝重指數(shù) (肝重指數(shù) =肝臟濕重/體重×100%)。檢測(cè)血清 TC，TG、HDL-C 、LDL-C、ALT、AST、FPG、FINS及瘦素水平，計(jì)算IRI:IRI=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.4 病理學(xué)觀察 取肝右葉相同部位大小 (1.0×0.8×0.3)cm兩塊肝組織放入4%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟脂肪變和炎癥表現(xiàn)，結(jié)果評(píng)定、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)［1，2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后分析，各組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 整個(gè)研究過(guò)程，各組大鼠均無(wú)死亡。C組大鼠活潑喜動(dòng)，毛發(fā)平整，飲食正常;M組大鼠肥胖少動(dòng)，性情溫順，精神萎靡、嗜睡，毛發(fā)粗糙凌亂欠光澤。兩用藥組大鼠均有不同程度的活動(dòng)及飲食減少，皮毛欠光澤。

2.2 各組大鼠體重、肝濕重、肝重指數(shù)及肝臟TG含量結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體重、肝濕重、肝重指數(shù)及肝臟TG含量結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠體重、肝濕重、肝重指數(shù)及肝臟TG含量結(jié)果比較(±s)

與M組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與R組比較，＊＊P＜0.01

組別 n 體重(mg) 肝濕重(mg) 肝重指數(shù)(%) 肝臟TG(mmol/L)2.81±0.51 M 10 496.23±25.96 19.89±1.58 4.00±0.15 4.64±0.32 R 10 478.60± 13.80△ 17.40± 1.64# 3.63± 0.25# 4.55± 1.01 Y 10 445.00±24.56##＊＊ 14.90± 1.41##＊＊ 3.34± 0.26# 3.53± 0.81 C 10 421.11±14.01## 11.79±1.43## 2.80±0.31####

2.3 病理學(xué)觀察 C組大鼠肝臟肉眼觀察呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑。M組大鼠肉眼見肝臟體積增大，邊緣變鈍，顏色呈土黃色，切面呈油膩狀。Y組大鼠部分肝臟接近正常，表面呈淺黃色，油膩狀減輕，指壓有彈性。R組大鼠肝臟變化不明顯。各組大鼠肝組織HE染色顯示:C組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)基本正常;M組大鼠肝臟呈中-重度肝細(xì)胞脂肪變，肝細(xì)胞明顯腫脹呈圓形，細(xì)胞核被擠向一邊，胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡，脂滴大小不等，甚至融合為大脂滴，少數(shù)可見有肝細(xì)胞碎屑樣壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見有纖維化改變;Y組大鼠肝臟呈輕度至中度脂肪變，肝細(xì)胞脂肪變數(shù)目減少，胞漿內(nèi)脂滴減少或消失，胞漿豐富，肝細(xì)胞脂肪變程度明顯改善。R組大鼠肝臟變化不明顯。

各組大鼠肝脂肪變和炎癥分級(jí)結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝脂肪變、炎癥改變分級(jí)比較 (±s)

表2 各組大鼠肝脂肪變、炎癥改變分級(jí)比較 (±s)

與M組比較，#P＜0.05;與R組比較，*P＜0.05

組別 n 脂肪變 炎癥程度C 10 0 0 M 10 3.06±0.47 1.45±0.63 R 10 2.93±0.59 1.36±0.52*Y 10 2.14 0.49#* 0.95±0.36#*

2.4 各組大鼠肝功能變化 見表3。

表3 各組大鼠肝功能變化比較(±s，U/L)

表3 各組大鼠肝功能變化比較(±s，U/L)

與M組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別n ALT AST C 10 45.61±5.64## 142.48±30.07##M 10 68.85±5.67 181.80±18.03 R 10 58.63±3.79# 142.66±17.22##Y 10 55.94±3.79## 129.11±11.36##

2.5 各組大鼠血脂變化 見表4。

表4 各組大鼠血脂結(jié)果比較 (±s，mmol/L)

表4 各組大鼠血脂結(jié)果比較 (±s，mmol/L)

與M組比較，##P＜0.01;與R組比較，*P＜0.05

組別n TG TC HDL-C LDL-C C 10 0.98±0.27## 1.26±0.15## 1.35±0.28## 0.16±0.06##M 10 2.26±0.40 2.12±0.19 0.77±0.15 0.49±0.04 R 10 1.33±0.23## 1.55±0.35## 0.97±0.12 0.43±0.12 Y 10 1.20±0.17## 1.47±0.15## 0.85±0.07 0.32±0.14##*

2.6 各組大鼠血糖、胰島素、IRI及瘦素變化 見表5。

表5 各組大鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及瘦素結(jié)果比較 (±s)

表5 各組大鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及瘦素結(jié)果比較 (±s)

與M組比較，##P＜0.01;與R組比較，*P＜0.05

組別 n FBG(mmol/L) FINS(uIU/ml) IRI Leptin(ng/mL)C 10 5.26±0.49## 97.20±16.12## 22.59±3.14## 0.25±0.05##M 10 7.76±0.72 155.56±25.37 53.85±11.98 0.76±0.06 R 10 6.32±0.68## 115.52±25.37##31.13±6.69## 0.41±0.08##Y 10 6.43±0.60## 126.39±23.05## 35.98±6.33## 0.35±0.03##*

3 討論

現(xiàn)代研究證實(shí)在脂肪肝的進(jìn)展過(guò)程中，IR通過(guò)外周脂肪降解和增加肝臟對(duì)脂肪酸的攝取而促進(jìn)脂肪變性的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示IR可進(jìn)一步引發(fā)高胰島素血癥與脂質(zhì)代謝紊亂，提示IR是脂質(zhì)代謝異常的重要因素。瘦素在脂肪肝的進(jìn)展過(guò)程中也發(fā)揮重要的作用，據(jù)報(bào)道［3］，肥胖癥及非酒精性脂肪肝病患者血清瘦素水平明顯升高，而高水平的內(nèi)源性瘦素亦可引起IR，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF2A等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞分化及內(nèi)臟脂肪積聚，促進(jìn)肝脂肪變性向脂肪性肝炎及肝纖維化進(jìn)展。因此，改善IR和降低瘦素水平對(duì)于NAFLD的防治有重要意義。

中藥藥對(duì)，是以辨證論治和藥物配伍理論為基礎(chǔ)，以病因病機(jī)和證候特點(diǎn)為依據(jù)，是臨床常配伍應(yīng)用的性味功效相關(guān)成組雙藥的統(tǒng)稱，亦是方劑最小的組方單位，通常是方劑的核心或主要組成部分，甚至是一首方劑，為古今醫(yī)家長(zhǎng)期醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)。研究單味中藥難以反映出其在復(fù)方中的真實(shí)作用，復(fù)方藥味多，作用關(guān)系復(fù)雜，其研究也難得出準(zhǔn)確結(jié)論。藥對(duì)作為藥配伍中的雛形，對(duì)其研究可以彌補(bǔ)上述研究的不足，深入探究藥對(duì)的作用規(guī)律，對(duì)于科學(xué)指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有重要的意義。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［4，5］，從人參中提取的人參總皂苷可明顯改善大鼠的血清TC、TG、HDL-C及LDL-C水平。除此之外［6］，人參皂苷具有抗炎抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，為人參皂苷用于脂肪性肝炎的防治提供理論依據(jù)。有報(bào)道稱［7，8］柴胡提取物如柴胡皂苷-d(SS-d)可明顯減少肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-SMA)的表達(dá)，從而抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化達(dá)到抗肝纖維化作用。研究［9］也發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷可明顯升高酒精性肝病大鼠肝組織活性、降低丙二醛(MDA)含量，降低血清轉(zhuǎn)氨酶 (ALT、AST)活性和TG含量，對(duì)酒精性肝病 (ALD)有明顯防護(hù)作用，其機(jī)制可能與柴胡總皂苷清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。柴胡人參在《傷寒論》、《金匱要略》中均為常用藥對(duì)，歷代醫(yī)家在外感及內(nèi)傷雜病中均有辨證使用柴胡人參藥對(duì)，如治療慢性肝膽疾病，因肝病久留不祛，易傷正氣;柴胡疏肝，順應(yīng)肝之調(diào)達(dá)之性，使氣機(jī)調(diào)暢;人參扶正，補(bǔ)脾氣而助運(yùn)化;兩藥合用，疏肝健脾，符合脂肪性肝病中醫(yī)的發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)證實(shí):柴胡人參藥對(duì)可改善NAFLD大鼠的糖脂代謝、胰島素抵抗和降低瘦素水平，其機(jī)制目前課題組正在作進(jìn)一步研究。

［1］ DIEHL AM，GOODMAN Z，ISHAK KG.Alcoholic disease in non-alcoholics:A clinical and histologic comprison with alcohol induced liver injury ［J］ .Gastroenterol，1988，95(4):1056 －1062.

［2］ KNODELL RG，ISHAK KG，BLACK WC，et al.Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological active in symptomatic chronic active hepatitis ［J］ .Hepatol，198l，1(5):43l－435.

［3］ LI YL，YANG M，MENG XD，et al.The relationship of leptin and adiponectin with insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Zhonghua ganzangbing zazhi，2010 ，18(6):459－462.

［4］胡巢鳳，陸大祥，孫麗萍.人參莖葉皂苷對(duì)小鼠脂肪肝的作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(5):663－667.

［5］徐云鳳，趙雨，幺寶金，等.人參蛋白對(duì)高脂血癥模型大鼠的降血脂作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22(2):138－141.

［6］陳冠敏，陳小萍，何聆，等.人參片對(duì)大鼠血脂水平及延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002，9(4):311－313.

［7］戈宏焱，陳博，劉會(huì)龍，等.柴胡皂苷對(duì)酒精性肝病大鼠的治療作用［J］.中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志，2011，2(31):662－663.

［8］李素婷，齊潔敏，楊鶴梅.柴胡總皂苷對(duì)大鼠酒精性肝病預(yù)防作用及其機(jī)制研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(10):1492－1493.

［9］何燕，胡志峰，李平.柴胡皂苷d抗肝纖維化大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化作用的研究 ［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(8):915－918.