夏正燕，馮瑛，潘建明

(浙江省中藥研究所，浙江 杭州 310012)

蜂膠毛膠中總黃酮、高良姜素和白楊素含量分析△

夏正燕*，馮瑛，潘建明

(浙江省中藥研究所，浙江 杭州 310012)

目的：建立蜂膠毛膠中總黃酮以及高良姜素、白楊素含量測(cè)定方法，測(cè)定不同基原毛膠中上述各指標(biāo)的含量。方法：以蘆丁為對(duì)照品，采用UV法測(cè)定總黃酮含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為415 nm；用HPLC同時(shí)測(cè)定高良姜素、白楊素含量，采用Welchrom C18柱，以甲醇-0.15%磷酸溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm。結(jié)果：總黃酮在0～1.248 mg線性關(guān)系良好，r=0.999 9(n=6)，平均回收率為98.82%，RSD=1.45%。高良姜素、白楊素分別在0.089～0.445 0，0.115～0.580 μg線性關(guān)系良好，r均達(dá)到1.000，平均回收率分別為99.03%、99.32%，RSD分別為1.10%、1.72%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)便易行，可用于蜂膠毛膠的定量分析，為蜂膠毛膠、其提取物以及蜂膠制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供了依據(jù)。

蜂膠毛膠；總黃酮；高良姜素；白楊素；基原；含量分析

蜂膠是蜜蜂采集植物莖、腋芽的樹脂并混入花粉、自身分泌物和蜂蠟，混合而成的一種具芳香氣味的膠狀固體物，其主要化學(xué)成分為黃酮類、萜烯類、酚酸類化合物等，其中黃酮類成分含量高達(dá)10%。從生物學(xué)活性角度看，蜂膠具有廣譜抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂血糖等十分廣泛的生物學(xué)作用[1]，故而成為獨(dú)特而寶貴的純天然保健食品資源和藥源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

黃酮類成分是蜂膠品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，而高良姜素、白楊素只有在天然原生蜂膠中才含有，《中國(guó)藥典》關(guān)于蜂膠功效成分檢測(cè)，將其作為含量測(cè)定項(xiàng)目[2]。為此，筆者進(jìn)行了本項(xiàng)研究[3-5]，以總黃酮、高良姜素和白楊素的含量來綜合評(píng)價(jià)蜂膠的質(zhì)量，可用于蜂膠的定量分析，為蜂膠、其提取物以及蜂膠制品的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器；Shimadzu UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

蘆丁、高良姜素、白楊素對(duì)照品(批號(hào)分別為0080-9504，111699-200501，111701-200501，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

蜂膠購(gòu)自吉林、浙江、安徽、山東等地蜂農(nóng)，經(jīng)浙江省中藥研究所楊蘇蓓教授鑒定為蜂膠。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的提取

取藥材粉末(過65目篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱重，50 ℃超聲提取2次，每次30 min，放冷，稱重，以95%乙醇補(bǔ)足原重，搖勻，濾過，即得。

2.2 總黃酮含量測(cè)定[6]

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加無水乙醇溶解配成濃度為0.2 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0，1，2，3，4，5，6 mL，置50 mL量瓶中，加95%乙醇至總體積為15 mL，依次加入硝酸鋁溶液(0.1 g·mL-1)1 mL，醋酸鉀溶液(9.8 g·L-1)1 mL，加水至刻度，搖勻，靜置1 h。于415 nm處，以試劑空白為參比，測(cè)定吸光度。以總黃酮含量為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.615 2X-0.000 2，r=0.999 9，線性范圍為0～1.248 mg。

2.2.3 供試品溶液的測(cè)定

2.2.3.1 供試品溶液的制備 精密吸取2.1項(xiàng)下濾液1 mL，置50 mL量瓶中，加95%乙醇至總體積為15 mL，按2.2.2項(xiàng)下制備。

2.2.3.2 空白試驗(yàn) 精密吸取2.1項(xiàng)下濾液1 mL，置于50 mL量瓶中，加95%乙醇至總體積為15 mL，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3.3 測(cè)定 以空白試驗(yàn)作參比，在415 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁計(jì)算其總黃酮的含量。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液6份，每份3 mL，按照2.2.2項(xiàng)下操作，分別測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算得RSD=1.03%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(河南產(chǎn))，按2.2.3項(xiàng)下操作，每隔20 min測(cè)定1次吸光度值，連續(xù)測(cè)定100 min，計(jì)算得A值的RSD=1.57%。表明供試品溶液的A值在100 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(河南產(chǎn))6份，按2.2.3項(xiàng)下操作，分別測(cè)定A值，得總黃酮含量的RSD=1.46%。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取藥材粉末(過65目篩)約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液(3.20 mg·mL-1)5 mL，按2.1及2.2.3項(xiàng)下操作，平行測(cè)定6份，計(jì)算得總黃酮平均回收率為98.82%，RSD=1.45%。

2.2.8 各基原蜂膠中總黃酮的測(cè)定 取各基原樣品粉末(過65目篩)約0.3 g，精密稱定，按2.1項(xiàng)下提取后，按2.2.3項(xiàng)下操作，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果見表3。

2.3 HPLC測(cè)定高良姜素和白楊素的含量

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.15%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。在上述條件下，高良姜素、白楊素的保留時(shí)間分別為18,22 min，理論塔板數(shù)不低于3 000，高良姜素、白楊素與其他組分達(dá)到基線分離，見圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間表

1.白楊素 2.高良姜素圖1 對(duì)照品(A)和河南蜂膠供試品(B)HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取高良姜素、白楊素對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL分別含約18,23 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液；另取白楊素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL約含30 μg，作為白楊素對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下的濾液，精密吸取2.5 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性范圍考察 精密吸取高良姜素、白楊素混合對(duì)照品溶液5.0，10，15，20，25 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別以高良姜素、白楊素對(duì)照品量為橫坐標(biāo)(X，μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得回歸方程為Y=3 288.9X-21.8，r=1.000；Y=4 674.2X-13.718，r=1.000。結(jié)果表明高良姜素、白楊素分別在0.089～0.445 0 μg，0.115～0.580 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定高良姜素及白楊素峰面積值，其RSD分別為0.54%，0.44%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的方法對(duì)同一樣品(河南產(chǎn))進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果表明，高良姜素、白楊素含量的RSD分別為0.72%、0.56%。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(河南產(chǎn))適量，按上述方法制成供試品溶液，放置0，2，4，8，12，24 h，分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果高良姜素、白楊素含量的RSD分別為0.70%、0.89%(n=6)，表明樣品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(河南產(chǎn))6份，分別精密加入高良姜素、白楊素混合對(duì)照品(濃度為2.90，3.00 mg·mL-1)1.0 mL，按樣品測(cè)定方法制成供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 高良姜素、白楊素回收率試驗(yàn)

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取樣品，按供試品溶液制備方法制備供試液，依上述色譜條件測(cè)定。各基原蜂膠樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同基原蜂膠樣品總黃酮、高良姜素及白楊素含量(n=3) /mg·g-1

3 討論

實(shí)驗(yàn)曾考察了不同的提取溶媒：甲醇、丙酮、95%乙醇、80%乙醇、65%乙醇，結(jié)果顯示95%乙醇提取效果最好。

曾對(duì)超聲、回流、索氏提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明超聲法提取較完全，且超聲提取2次，每次30 min較為合適。

曾對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行過考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.15%磷酸(64∶36)為流動(dòng)相，分離較好且峰形佳，但分析周期較長(zhǎng)；而采用梯度洗脫，能大大地縮短分析時(shí)間，節(jié)省了人力、物力。

不同基原蜂膠中總黃酮含量有差異，白楊素和高良姜素的含量差別更大，大部分蜂膠都是白楊素含量高于高良姜素，各指標(biāo)與基原的相關(guān)性仍有待于進(jìn)一步研究。

[1] 朱恩圓，竇玉玲，魏東芝，等.蜂膠HPLC指紋圖譜及質(zhì)量控制[J].中國(guó)中藥雜志,2005,30(18):1423.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:336.

[3] 王小平，林勵(lì)，陳振霖，等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地蜂膠中高良姜素的含量[J].中草藥,2007,30(5):560.

[4] 黃煥婷，黃海潮.不同產(chǎn)地蜂膠中總黃酮的提取及含量測(cè)定[J].廣東化工,2010,37(205):215.

[5] 曹煒，符軍放，索志榮，等.蜂膠中白楊素和高良姜素的HPLC分析[J].藥物分析雜志,2007,27(4):522.

[6] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).蜂膠中總黃酮含量的測(cè)定方法分光光度比色法[S].GB/T 20574-2006.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

關(guān)于舉辦中藥資源化學(xué)研究與資源有效利用的新思路新方法培訓(xùn)班的通知

中藥資源是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展賴以生存的基礎(chǔ)，是中藥材生產(chǎn)與質(zhì)量保證的源頭，關(guān)系到中醫(yī)藥行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為了加深中醫(yī)藥行業(yè)相關(guān)從業(yè)人員和教學(xué)科研工作者對(duì)中藥資源學(xué)科建設(shè)及國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展戰(zhàn)略的認(rèn)識(shí)，準(zhǔn)確把握中藥資源學(xué)科的內(nèi)涵和研究范疇，掌握中藥資源學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域科研思路與方法，培養(yǎng)中藥資源學(xué)科人才隊(duì)伍，不斷提高學(xué)科的建設(shè)水平，確保中醫(yī)藥事業(yè)健康、穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展，由國(guó)家中醫(yī)藥管理局主辦，南京中醫(yī)藥大學(xué)承辦的國(guó)家級(jí)中醫(yī)藥繼續(xù)教育項(xiàng)目“中藥資源化學(xué)研究與資源有效利用的新思路新方法暨中藥資源與開發(fā)專業(yè)系列規(guī)劃教材培訓(xùn)學(xué)習(xí)班”(項(xiàng)目編號(hào)2013100104062)將于2013年11月22日～25日在南京舉行。此次培訓(xùn)對(duì)象包括中醫(yī)藥行業(yè)中藥士、中藥師、工程師、農(nóng)藝師、生產(chǎn)技術(shù)人員，各大專院校及科研院所從事中藥資源及相關(guān)專業(yè)的教學(xué)、科研工作人員等，參會(huì)代表可獲國(guó)家級(jí)Ⅰ類繼續(xù)教育學(xué)分證書(10分)。具體會(huì)議內(nèi)容詳見http://yxy.njutcm.edu.cn/show.asp?cid=12&id=21172046。

聯(lián)系人：嚴(yán)輝13512537853 劉圣金13770653305

傳真：025-85811524報(bào)名郵箱： tryw2010@126.com

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DeterminationofTotalFlavonoids,GalanginandChrysininPropolisofDifferentOrigins

XIA Zheng-yan*,FENG Ying，PAN Jian-ming

(ZhejiangResearchInstituteofTraditionalChineseMedcine，Hangzhou310023,China)

Objective： To establish UV and HPLC methods for determination of total flavonoids,galangin and chrysin in Propolis.Methods： UV method was used to determine total flavonoids,and the detection wavelength was 415 nm.The analysis of Galangin and Chrysin was performed on a Welchrom C18column with a gradient solvent system of methanol-0.15% phosphoric acid solution,and the detection wavelength was 268 nm.Results: The linear range of rutin was 0～1.248 mg(r=0.999 9),and the average recovery was 98.82% with RSD 1.45%.The linear range of galangin and chrysin in propolis were 0.089～0.445 0 μg and 0.115～0.580 μg,both with good correlation(r=1.000).The average recovery were 99.03% for galangin and 99.32% for chrysin,and RSD were 1.10% and 1.72%,respectively(n=6).Conclusion：The methods are simple and reliable for quantitative analysis of propolis,its extracts and products,and can be used for quality control and evaluation.

Propolis；Total flavonoids；Galangin；Chrysin；Origin；Content determination

2013-01-09)

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浙江省分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011C37066)

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夏正燕，E-mail：xzhengyan@gmail.com