劉鳳波，侯俊玲*，王文全,2,3*，于福來(lái)，趙志剛，郜舒蕊，韓亞男

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

不同來(lái)源黃芪中黃芪總皂苷含量比較研究△

劉鳳波1，侯俊玲1*，王文全1,2,3*，于福來(lái)4，趙志剛1，郜舒蕊1，韓亞男1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

目的：比較全國(guó)不同來(lái)源黃芪中總皂苷含量。方法：采用紫外分光光度法測(cè)定黃芪總皂苷含量，以黃芪甲苷為對(duì)照品，測(cè)定波長(zhǎng)為541 nm。結(jié)果：全國(guó)黃芪總皂苷平均含量為20.18 mg·g-1，蒙古黃芪總皂苷平均含量為21.06 mg·g-1，膜莢黃芪總皂苷平均含量為19.37 mg·g-1；野生黃芪藥材總皂苷平均含量為21.33 mg·g-1，人工種植黃芪藥材總皂苷平均含量為19.06 mg·g-1，半野生栽培黃芪藥材總皂苷平均含量為18.97 mg·g-1。結(jié)論：不同來(lái)源黃芪藥材總皂苷含量具有明顯差異。

蒙古黃芪；膜莢黃芪；黃芪總皂苷；紫外分光光度法；含量比較

黃芪是我國(guó)重要的大宗常用中藥材之一，為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌功能[1]。其中皂苷類(lèi)成分為黃芪中主要的有效成分之一，具有降壓、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)代謝等作用[2-4]，是黃芪注射液[5]、參芪注射液[6]、補(bǔ)中益氣丸[7]等常用中成藥的主要有效成分。

黃芪在我國(guó)分布較廣，主要生長(zhǎng)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江、吉林、遼寧、陜西、河北、山東、寧夏等地，此外青海、四川、新疆等地區(qū)以及朝鮮、蒙古、俄羅斯亦有分布[8]。有關(guān)學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地黃芪中所含化學(xué)成分種類(lèi)研究成果大致相同，但由于環(huán)境及人為等因素致使其有效成分含量并不完全一樣[9-10]。

作者依據(jù)黃芪的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)，并兼顧其他分布區(qū)的原則，對(duì)內(nèi)蒙古、山西、甘肅等10個(gè)省份不同基原、不同種植方式的黃芪藥材進(jìn)行調(diào)查與采集，利用紫外分光光度法測(cè)定黃芪藥材中總皂苷(astragali total saponins，ATS)的含量，以期明確我國(guó)黃芪藥材中黃芪總皂苷的整體含量，進(jìn)而對(duì)以黃芪為主的中成藥的生產(chǎn)、臨床使用以及藥理作用研究產(chǎn)生一定的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP211D型電子分析天平；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱；SP-754(PC)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：110702)，水為娃哈哈純凈水。正丁醇、氨水、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

1.3 材料

于2010年7～8月調(diào)查采集山西、內(nèi)蒙古、甘肅、河北、黑龍江、吉林、寧夏、陜西、遼寧以及山東等10省份共計(jì)118個(gè)樣方黃芪藥材，包括55個(gè)蒙古黃芪和63個(gè)膜莢黃芪樣方在內(nèi)的61個(gè)野生樣方，52個(gè)人工種植樣方及5個(gè)半野生栽培(即將種子播種在山上，6～8年后采挖，此栽培方式為半野生栽培)樣方。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定，為豆科黃芪屬植物膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系實(shí)驗(yàn)室。將黃芪藥材分別烘干、稱(chēng)重、粉碎，粉末全部過(guò)60目篩，于50 ℃烘干，備用。實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源情況匯總見(jiàn)表1。

表1 黃芪來(lái)源統(tǒng)計(jì)

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品2.07 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.207 mg·mL-1黃芪甲苷的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取黃芪藥材粉末(過(guò)60目篩)0.5 g，精密稱(chēng)定，加甲醇25 mL，加熱回流1 h，過(guò)濾，減壓回收甲醇(65 ℃)，殘?jiān)?5 mL水飽和正丁醇分3次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，氨試液洗滌3次，每次15 mL，正丁醇層減壓回收至干，用甲醇溶解，溶液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，即得黃芪總皂苷的供試品溶液。

2.3 溶液的顯色

分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.5 mL，于具塞玻璃試管中，空氣吹干后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，于60 ℃水浴加熱20 min，取出后立即冰浴，冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻，用于吸光度測(cè)定。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別精密量取對(duì)照品溶液和樣品(渾源縣半野生蒙古黃芪)溶液各1 mL于具塞玻璃試管中，按照2.3中方法進(jìn)行顯色，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，對(duì)照品溶液和樣品溶液在541 nm均有較大吸收，故確定黃芪總皂苷測(cè)定波長(zhǎng)為541 nm。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.207 mg·mL-1)0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別按2.3項(xiàng)溶液顯色中相應(yīng)要求同法操作，以空白溶劑同法處理作參比，于541 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，以吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行回歸計(jì)算，得到黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程Y=1.778X-9×10-3，r=0.999。黃芪甲苷在41.4～517.5 μg內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 分別取黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，依次按2.3項(xiàng)下要求同法操作，連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得吸光度值，外標(biāo)一點(diǎn)法求得總皂苷含量，RSD=1.02%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材(渾源縣半野生蒙古黃芪)，依次按2.2和2.3項(xiàng)下要求同法操作，測(cè)得吸光度值，外標(biāo)一點(diǎn)法求得黃芪總皂苷含量，RSD=1.04%(n=6)，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液3份(1.0 mL)，依次按2.3項(xiàng)下要求同法操作，室溫放置，分別在0，1，2，4，6，8，10，12，24 h測(cè)定吸光度值，外標(biāo)一點(diǎn)法求得黃芪總皂苷含量，計(jì)算RSD=1.01%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液顯色后室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

分別取同一批藥材(渾源縣半野生蒙古黃芪)3份，依次按2.2和2.3項(xiàng)下要求同法操作，室溫放置，分別在0，1，2，4，6，12 h測(cè)定吸光度值，外標(biāo)一點(diǎn)法求得黃芪總皂苷含量，計(jì)算RSD=1.00%，結(jié)果表明供試品溶液顯色后室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 取黃芪藥材9份(錫林郭勒盟野生蒙古黃芪)，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入不同量的黃芪甲苷對(duì)照品適量，制備低、中、高不同濃度的供試品溶液，每一濃度3份，按2.2和2.3項(xiàng)下要求同法操作，測(cè)定吸光度，黃芪總皂苷平均回收率為98.5%(RSD=1.49%)。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

每批黃芪藥材平行取3份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，按2.2和2.3項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算黃芪總皂苷含量。

3 結(jié)果與分析

使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如下。

3.1 不同基原黃芪總皂苷含量分析

通過(guò)對(duì)所有樣方中黃芪藥材進(jìn)行測(cè)定，全國(guó)黃芪總皂苷含量平均為20.18 mg·g-1。其中，全國(guó)各產(chǎn)地的蒙古黃芪和膜莢黃芪總皂苷含量平均值分別為21.06 mg·g-1和19.37 mg·g-1，通過(guò)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 不同種植方式黃芪總皂苷含量分析

通過(guò)對(duì)野生黃芪、半野生黃芪、人工種植黃芪3種不同種植方式的黃芪藥材進(jìn)行總皂苷含量的測(cè)定，經(jīng)分析，不同種植方式的黃芪藥材中總皂苷含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生黃芪與人工種植黃芪藥材中總皂苷含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中，野生黃芪含量最高(21.33 mg·g-1)，為半野生黃芪(18.97 mg·g-1)及人工種植黃芪(19.06 mg·g-1)的1.13倍和1.12倍。

3.3 全國(guó)不同產(chǎn)地黃芪總皂苷含量分析

通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古、山西、甘肅、陜西、河北、寧夏、黑龍江、吉林、遼寧及山東共10個(gè)省份產(chǎn)黃芪藥材總皂苷測(cè)定分析，結(jié)果表明不同產(chǎn)地之間黃芪藥材總皂苷含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中總皂苷含量最高的省份為內(nèi)蒙古自治區(qū)(22.93 mg·g-1)，為總皂苷含量最低的山東省(15.74 mg·g-1)的1.46倍，其次為河北省(22.32 mg·g-1)和遼寧省(22.18 mg·g-1)。全國(guó)不同產(chǎn)地黃芪總皂苷含量對(duì)比見(jiàn)圖1。

圖1 全國(guó)不同產(chǎn)地黃芪總皂苷含量對(duì)比圖

多重比較分析結(jié)果表明，內(nèi)蒙古黃芪總皂苷含量(22.93 mg·g-1)顯著高于山西、甘肅、黑龍江、吉林以及山東(P<0.05)。河北省黃芪總皂苷含量(22.32 mg·g-1)和遼寧省黃芪總皂苷含量(22.18 mg·g-1)顯著高于山東省(P<0.05)。山西、陜西、寧夏、黑龍江及吉林黃芪總皂苷含量差異相互之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3.1 各產(chǎn)地蒙古黃芪中總皂苷含量分析 通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古、山西、甘肅、陜西、河北及寧夏產(chǎn)蒙古黃芪進(jìn)行總皂苷測(cè)定，各產(chǎn)地總皂苷含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。總皂苷平均含量最高的為河北省和內(nèi)蒙古自治區(qū)，分別為23.75 mg·g-1和23.55 mg·g-1，為總皂苷含量最低的甘肅省樣品(16.55 mg·g-1)的1.44倍和1.42倍。各產(chǎn)地蒙古黃芪總皂苷含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖2。

圖2 各產(chǎn)地蒙古黃芪總皂苷含量對(duì)比圖

3.3.2 各產(chǎn)地膜莢黃芪中總皂苷含量分析 通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、寧夏、甘肅、山東、河北以及陜西產(chǎn)膜莢黃芪進(jìn)行總皂苷測(cè)定，各產(chǎn)地總皂苷含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總皂苷平均含量最高的陜西省(23.14 mg·g-1)為含量最低的甘肅省樣品(15.64 mg·g-1)的1.48倍。各產(chǎn)地膜莢黃芪中總皂苷含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖3。

圖3 各產(chǎn)地膜莢黃芪總皂苷含量對(duì)比圖

4 結(jié)論與討論

4.1 不同來(lái)源黃芪總皂苷含量差異明顯

研究所用黃芪藥材均為本研究團(tuán)隊(duì)在較短時(shí)間內(nèi)在黃芪分布區(qū)采集的樣品，保證了藥材來(lái)源的準(zhǔn)確性和可比性。分析結(jié)果顯示，蒙古黃芪和膜莢黃芪中總皂苷的含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蒙古黃芪中總皂苷含量高于膜莢黃芪，該結(jié)論與1984年《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》中優(yōu)先發(fā)展蒙古黃芪的結(jié)論相吻合[11]。野生黃芪藥材中總皂苷含量較人工種植黃芪高，導(dǎo)致這種差異的原因可能是由于種植方式、生長(zhǎng)環(huán)境及生長(zhǎng)年限等因素，該結(jié)論與劉靖等研究結(jié)論相一致[12]，并更具有代表性，因此，在開(kāi)發(fā)黃芪皂苷類(lèi)相關(guān)的過(guò)程中可優(yōu)先考慮野生黃芪藥材。在對(duì)全國(guó)黃芪藥材進(jìn)行采集過(guò)程中，黑龍江、吉林、遼寧以及山東等四省沒(méi)有采集到蒙古黃芪藥材，可能原因?yàn)榈乩?、氣候及人為因素?dǎo)致上述地區(qū)沒(méi)有蒙古黃芪分布，具體原因尚待進(jìn)一步研究；山西省沒(méi)有采集到膜莢黃芪藥材，說(shuō)明蒙古黃芪和膜莢黃芪分布并不完全一致，該結(jié)論與趙一之[13]的研究報(bào)道并不完全一致。

4.2 黃芪總皂苷含量高低與黃芪傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)劃分并不完全一致

傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)之一內(nèi)蒙古自治區(qū)所產(chǎn)的黃芪中總皂苷含量均較其他省份高，而傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)山西、黑龍江省所產(chǎn)黃芪中總皂苷含量并非較高。黃芪主產(chǎn)區(qū)甘肅省和山東省產(chǎn)黃芪中總皂苷含量均較低，而河北省及遼寧省產(chǎn)黃芪總皂苷含量?jī)H次于內(nèi)蒙古地區(qū)。黃芪的道地性受多方面因素的影響，分析結(jié)果顯示黃芪總皂苷含量與黃芪道地產(chǎn)區(qū)的分布并不完全一致，影響黃芪總皂苷含量的氣候、環(huán)境等因素以及其與黃芪甲苷存在何種相關(guān)性仍需進(jìn)一步考察。

盡管有部分學(xué)者對(duì)黃芪總皂苷含量提取及含量測(cè)定方法進(jìn)行了較多的研究[14-16]，但系統(tǒng)地對(duì)不同來(lái)源的黃芪進(jìn)行總皂苷含量測(cè)定鮮有報(bào)道[17]，只有在較全面的調(diào)查分析基礎(chǔ)上才能制定更加合理的開(kāi)發(fā)方案。因此，為了對(duì)不同來(lái)源的黃芪進(jìn)行更加合理的開(kāi)發(fā)，需要對(duì)黃芪中多種有效成分進(jìn)行測(cè)定分析。針對(duì)多來(lái)源黃芪，建議一方面應(yīng)加大力度保護(hù)野生藥材，保護(hù)野生黃芪產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境；另一方面，針對(duì)不同來(lái)源的黃芪制定相應(yīng)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)一藥一品一標(biāo)準(zhǔn)。

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ComparationoftheContentsofAstragaliTotalSaponinsamongDifferentOrigins

LIU Feng-bo1,HOU Jun-ling1*,WANG Wen-quan1,2,3*,YU Fu-lai4,1,ZHAO Zhi-gang1,HAO Shu-rui1,HAN Ya-nan1

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China;2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;3.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China)4.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina,Danzhou571737，China)

Objective： To investigate the contents of astragali total saponins(ATS)in Astraglus among different origins.Methods： They are measured by the method of ultraviolet spectrophotometry,Astragaloside IV was used as index，the test wavelength was 416 nm.Results: The ATS average content of the whole country was 20.18 mg·g-1,the ATS content in astragali radix fromA.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao was 21.06 mg·g-1,fromA.membranaceus(Fisch.)Bge.was 19.37 mg·g-1,the content of ATS in wild,cultured,semi-wild samples were 21.33,19.06 and 18.97 mg·g-1respectively.Conclusion: The contents of ATS in Astragalus among different habitats have obvious difference.

Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao；A.membranaceus(Fisch.)Bge.； Astragali total saponins； Ultraviolet spectrophotometry； Contents comparison

2012-12-21)

△

珍稀瀕危和大宗常用藥用植物資源調(diào)查——膜莢黃芪與蒙古黃芪資源調(diào)查(2010FY110600)；北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀研究生自主選題項(xiàng)目(2011-JYZBB-XS060)

*

侯俊玲，E-mail：mshjl@126.com；王文全，Tel：(010)84738334，E-mail：wwq57@126.com