王卓，于慧美，劉鼎，高微，田義新*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130033；2.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021)

人參內(nèi)生真菌的分離及其抗腫瘤活性研究

王卓1，于慧美2，劉鼎1，高微2，田義新1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130033；2.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021)

目的：從人參中分離獲得人參內(nèi)生真菌，并初步探討其代謝產(chǎn)物粗提物的抗腫瘤活性。方法：研究利用篩選培養(yǎng)基從6年生人參中分離內(nèi)生真菌，并利用小瓊脂塊培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法對(duì)獲得的人參內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，利用MTT法檢測其體外抗腫瘤活性。結(jié)果：從人參中共計(jì)分離得到內(nèi)生真菌28株，其中2株活性較好。結(jié)論：從藥用植物人參中分離得到的人參內(nèi)生真菌具有潛在的抗腫瘤活性，為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤藥物提供新的研究對(duì)象。

人參；內(nèi)生真菌；分離；生物活性；抗腫瘤

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬植物，以干燥根及根莖入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智功能，是吉林省的道地藥材[1-2]。眾所周知，人參是傳統(tǒng)的名貴藥材，含有豐富的人參皂苷、多種氨基酸、多糖及揮發(fā)油等成分，對(duì)人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)等具有廣泛的作用，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)有害刺激的抵抗力[3-5]。

內(nèi)生真菌是生活于健康植物的組織細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)，且不會(huì)造成明顯疾病癥狀的真菌[6]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，從多種植物中都可以分離獲得內(nèi)生真菌[7]。在自然生態(tài)系統(tǒng)中，生活在健康植物內(nèi)部組織的內(nèi)生真菌與宿主表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用，兩者建立了一個(gè)和諧的共生系統(tǒng)并從中受益。植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，其中很多與宿主植物的代謝產(chǎn)物相同或相類似，因此已成為尋找天然藥物的重要來源。如今，有關(guān)植物內(nèi)生菌的研究報(bào)道有很多，但是關(guān)于人參內(nèi)生真菌的相關(guān)研究卻相對(duì)較少。

作者從藥用植物人參中分離獲得人參內(nèi)生真菌，并進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究，結(jié)果顯示，人參內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有潛在的抗腫瘤活性，這為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤藥物提供了新的研究對(duì)象。

1 材料

1.1 植物材料及細(xì)胞株

人參于2012年10月18日采自吉林省撫松縣二道河鎮(zhèn)人參生產(chǎn)基地，6年生；人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院。

1.2 真菌培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)液

真菌分離、鑒定的培養(yǎng)基包括PDA固體培養(yǎng)基、DRBC培養(yǎng)基(含氯霉素、鏈霉素等細(xì)菌抗生素)、PDB液體培養(yǎng)液；細(xì)胞培養(yǎng)液采用含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液。

2 方法

2.1 植物內(nèi)生真菌的分離

挑取新鮮人參，去掉泥土、蘆頭、參須等后，用蒸餾水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇浸泡1 min，然后用5%NaClO 溶液浸泡5 min，再用75%乙醇浸泡30 s，最后用無菌水沖洗4次；用無菌的濾紙吸干人參表面的水分，用消過毒的手術(shù)刀片將人參切成5 mm×5 mm×5 mm見方的小塊接種于DRBC培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種數(shù)個(gè)小塊，每個(gè)小塊間隔距離大于3 cm，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待觀察到從植物小塊內(nèi)部長出真菌菌絲時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 植物內(nèi)生真菌的鑒定

利用小瓊脂塊培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法對(duì)分離的植物內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。小瓊脂塊接種真菌菌絲及孢子，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時(shí)觀察真菌生長情況，根據(jù)菌絲、孢子生長情況對(duì)真菌進(jìn)行歸屬鑒定；提取真菌基因組DNA，利用ITS通用引物，擴(kuò)增真菌的ITS基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后通過與NCBI序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)后，對(duì)其歸屬進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定[8]。

2.3 植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物粗體物的提取

于1 L培養(yǎng)瓶中接種300 mL PDB液體培養(yǎng)液，將分離出的人參內(nèi)生真菌接種于培養(yǎng)液中，置于28 ℃搖床中培養(yǎng)15 d。采用四層紗布過濾除去菌絲體，獲得的濾液采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并濃縮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為干粉，即為乙酸乙酯粗提物，稱重。

2.4 植物內(nèi)生菌抗腫瘤活性研究

乙酸乙酯粗提物經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)溶解后，用PBS以倍比稀釋法稀釋粗提物。采用MTT法測定粗提物的抗腫瘤活性。96孔板中按1×104每孔接種細(xì)胞，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h。待細(xì)胞融合率達(dá)到80%，加入不同濃度的乙酸乙酯粗提物，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔中加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT作用4 h，吸凈培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO溶解形成的甲臜(formazan)，于570 nm測定吸光度值。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果

3.1 人參內(nèi)生真菌分離、鑒定

經(jīng)過在DRBC培養(yǎng)基上4～21 d的培養(yǎng)，共從人參組織塊中分離出人參內(nèi)生真菌28株，利用小瓊脂塊培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法對(duì)獲得的人參內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，人參中包含的真菌包括鐮刀菌、毛霉、木霉、地霉、青霉等。其中，鐮刀菌為人參內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)種群，占到分離獲得的人參內(nèi)生真菌總數(shù)的46.4%，見表1。

3.2 人參內(nèi)生真菌抗腫瘤活性研究

將從人參內(nèi)生真菌組織塊中分離出的28株人參內(nèi)生真菌置于PDB液體28 ℃搖床中發(fā)酵培養(yǎng)15 d后，經(jīng)紗布過濾除去菌絲體，獲得的濾液采用乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后濃縮為干粉，DMSO溶解。

MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMSO終濃度為1×10-5mmol·L-1，對(duì)細(xì)胞生存率無影響。28株人參內(nèi)生真菌乙酸乙酯粗提物中有兩株對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的IC50達(dá)到60～140 μg·mL-1(見圖1)。綜合前人的研究結(jié)果，這兩株內(nèi)生真菌粗提物的抗腫瘤活性較理想，可進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以分析獲得其抗腫瘤活性。

表1 人參內(nèi)生真菌的分離鑒定

圖1 MTT法檢測人參內(nèi)生真菌乙酸乙酯粗提物抗腫瘤活性

4 討論

人參作為傳統(tǒng)的名貴藥用植物，其在醫(yī)學(xué)上的功效早已為人們所熟知，但是從資源利用的角度來說，人參同其他名貴珍稀藥用植物一樣存在資源少、價(jià)格昂貴等弊端，而人參內(nèi)生菌的深入研究將緩解甚至可以解決這一問題。在長期與宿主的協(xié)同進(jìn)化過程中，內(nèi)生真菌與宿主植物為了保持一個(gè)穩(wěn)定的共生關(guān)系，可以產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的化學(xué)成分，人參內(nèi)生菌完全可能成為替代人參而獲取人參皂苷成分的新資源。

近年來，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到了植物內(nèi)生細(xì)菌及內(nèi)生真菌是獲得新活性物質(zhì)的重要來源之一[7]。植物內(nèi)生真菌研究是人們利用微生物對(duì)人參資源開發(fā)和研究的一種新的思路和方式[6，9]。植物內(nèi)生真菌由于其特殊的生存環(huán)境，次生代謝產(chǎn)物豐富，可能會(huì)產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的新成分[10]。有專家認(rèn)為內(nèi)生真菌是次級(jí)代謝產(chǎn)物的“金庫”，且內(nèi)生真菌是一片未被完全探索和開發(fā)的領(lǐng)域。因此，從內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已引起研究者極大的興趣[10]。許多從內(nèi)生真菌分離純化的新化合物被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒和抗原蟲的作用。

人參內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物是否豐富，是否含有結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，是否具有抗腫瘤等生物活性，是我們關(guān)注的焦點(diǎn)。我們選擇人參進(jìn)行內(nèi)生真菌分類學(xué)及次生代謝產(chǎn)物研究，為揭示我國人參內(nèi)生真菌的種類多樣性及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，以及開發(fā)醫(yī)藥新資源提供依據(jù)。研究中獲得的GS-4及GS-22兩株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物具有良好的體外抗腫瘤活性，提示我們可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物的分離純化，尋找具有抗腫瘤活性的成分。

綜上，該研究利用篩選培養(yǎng)基從6年生人參中分離28株內(nèi)生真菌，利用小瓊脂塊培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法對(duì)獲得的人參內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，并通過MTT法初步篩選獲得了體外抗腫瘤活性較好的2株人參內(nèi)生真菌，為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤藥物提供了新的研究對(duì)象。

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IsolationandAntitumorActivityResearchofEndophyticFungifromPanaxginseng

WANG Zhuo1，YU Hui-mei2，LIU Ding1，GAO Wei2，TIAN Yi-xin1*

(1.CollegeofTCMMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130033，China；2.NormanBethuneCollegeofMedicine，JilinUniversity，Changchun130021，China)

Objective：To isolate endophytic fungi fromPanaxginsengand study their antitumor activity.Methods：Endophytic fungi were isolated from 6-year-oldPanaxginseng.Their antitumor activities were analyzed by MTT methodinvitro.Results：28 endophytic fungi were isolated fromPanaxginseng，and 2 of them showed potential antitumor activity.Conclusion：Endophytic fungi isolated fromPanaxginsenghas antitumor activities，could be potential antitumor drugs.

Panaxginseng；Endophytic fungi；Isolation；Bioactivity；Antitumor activity

2013-03-02)

*

田義新，Tel：(0431)84533304，E-mail：y.x.tian2003@163.com