陳秀俠，滕大才，李 軍，胡忠浩

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，江蘇徐州 221002；3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州 325027）

熱休克蛋白70（Hsp70）是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的保護(hù)因子，能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的能量供應(yīng)和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，減少缺血壞死范圍，抑制細(xì)胞凋亡等［1］，在腦缺血再灌注中發(fā)揮了保護(hù)作用。亞低溫在大量的動物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)對腦缺血有顯著的保護(hù)作用并逐漸應(yīng)用于臨床［2-3］，但其腦保護(hù)的機(jī)制仍不十分清楚。本研究旨在通過動態(tài)觀察Hsp70在腦缺血后及亞低溫處理后的沙土鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)，探討Hsp70和亞低溫腦保護(hù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組 蒙古沙土鼠由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄不拘，體質(zhì)量50～80g。實(shí)驗(yàn)前在22～25℃實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)1～2d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（SH組），分離雙側(cè)頸總動脈但不阻斷，維持正常體溫（37±0.5）℃；假手術(shù)低溫組（HSH組），手術(shù)同SH組，5min后鼓膜溫度降至（33±0.5）℃，持續(xù)4h；再灌注常溫組（IR組），應(yīng)用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5min，松開動脈恢復(fù)腦血流灌注，再灌注時維持正常體溫；再灌注低溫組（HIR組）：缺血5 min再灌注即刻降溫，10min內(nèi)鼓膜溫度降至（33±0.5）℃并維持4h。每組30只，根據(jù)缺血再灌注后的不同時間點(diǎn)各組再分為再灌注2h、4h、1d、3d、5d亞組（每亞組n=6）。4組中SH組、HSH組相對于其他兩組為對照組，只有IR組、HIR組有腦缺血再灌注過程。

1.1.2 制備模型 沙土鼠戊巴比妥鈉40mg／kg腹腔注射麻醉后，俯臥位下在前囟后2mm、矢狀縫外2mm處，置入電極，固定，接多功能腦電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測腦電圖。后仰臥位下切開頸部正中皮膚，分離雙側(cè)頸總動脈，用無創(chuàng)微動脈夾夾閉血流造成前腦缺血，5min后松開動脈夾恢復(fù)腦血流再灌注。缺血模型制備成功標(biāo)志是雙側(cè)頸總動脈夾閉后1min內(nèi)腦電圖成等電位，并剔除未成等電位的動物。將動物置于流動空氣浴箱中，用冰塊降溫或燈泡加熱的方法維持動物鼓膜溫度在所需溫度。

1.2 方法

1.2.1 行為學(xué)觀察 沙土鼠行為學(xué)變化用開闊法測定［3］。所用觀察木箱為76cm×72cm×57cm，箱底均分為25小格。由同一不知情的實(shí)驗(yàn)員單獨(dú)在周圍環(huán)境條件一致的同一房間內(nèi)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。將沙土鼠在再灌注后1、3、5d時間點(diǎn)放入木箱，記數(shù)動物10min爬行的格子數(shù)。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 在預(yù)定時間點(diǎn)，沙土鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60mg／kg，麻醉后開胸，經(jīng)主動脈灌注生理鹽水50 mL，繼以灌注10%的中性甲醛100mL，斷頭取腦，冠狀切面切開視交叉后1mm及4mm處，取中間塊在相同固定液中固定10d，石蠟包埋。在海馬齒狀互包平面連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm。切片進(jìn)行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測。采用細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒In Situ Cell Detection Kit，cp試劑盒染色（德國寶靈曼公司），參照試劑盒方法并做部分修改，同時設(shè)立陽性（加脫氧核糖核酸酶I DNasel，1μg／mL）和陰性對照（不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶TdT）。高倍鏡（40×10）計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)中段1mm長范圍內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)程序及圖像分析 采用Sant Cruz公司的鼠抗Hsp70抗體，其稀釋度為1∶100，北京中山生物技術(shù)公司的SP免疫組化試劑盒。陰性對照采用等稀釋度的鼠抗IgG。詳細(xì)操作方法見文獻(xiàn)［4］。采用德國Leica公司的LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)對Hsp70免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行圖像分析。取每張切片CA1區(qū)中1／3段測量平均灰度值，減去此片背景平均灰度值，取其相反數(shù)作為最終光密度值（OD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 亞低溫對沙土鼠缺血再灌注后行為學(xué)的影響 沙土鼠前腦缺血5min再灌注后1、3、5d的爬行格子數(shù)SH組與HSH組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；IR組較SH組明顯增加（P＜0.05），分別是SH組的3.2、1.8、1.9倍。HIR組僅僅在再灌注后1d的爬行格子數(shù)較SH組增加（P＜0.05），3、5d時比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；較IR組各時間點(diǎn)均減少（P＜0.05），分別是IR組的46%、71%、65%。見表1。

2.2 亞低溫對沙土鼠缺血再灌注后CA1區(qū)凋亡錐體細(xì)胞數(shù)的影響 未缺血沙土鼠CA1區(qū)無凋亡錐體細(xì)胞，IR組凋亡細(xì)胞較SH組明顯增加（P＜0.05）；與IR組比較，HIR組各時間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)分別減少85%、50%、41%（P＜0.05）。見表2、圖1。

2.3 亞低溫對沙土鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Hsp70表達(dá)的影響 未缺血SH組及HSH組沙土鼠僅有極少量的Hsp70在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元表達(dá)，亞低溫對其沒有明顯影響，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Hsp70在缺血再灌注2h時，表達(dá)沒有增加；4h時IR組沙土鼠CA1區(qū)已經(jīng)大量表達(dá)，至1d表達(dá)達(dá)高峰，3d時已經(jīng)降低，5d時表達(dá)仍較高（各點(diǎn)與SH組相比，P＜0.01）。HIR組4h時間點(diǎn)與IR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1d后Hsp70表達(dá)急劇增加，至5d時表達(dá)仍維持在高水平，與IR組各時間點(diǎn)相比均顯著增高（P＜0.01）。見表3、圖2。

表1 各組沙土鼠爬行的格子數(shù)的比較（，n=6）

表1 各組沙土鼠爬行的格子數(shù)的比較（，n=6）

273±73 289±46 269±66 IR組 864±84 520±168 515±137 HSH組 294±51 282±43 294±67 HIR組1d 3d 5d SH組組別402±74 368±34 339±45

表2 各組沙土鼠海馬CA1區(qū)凋亡錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較（，n=6）

表2 各組沙土鼠海馬CA1區(qū)凋亡錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較（，n=6）

1d 3d 5d SH組組別0 0 0 IR組 14.0±1.4 24.8±7.0 21.5±4.1 HSH組 0 0 0 HIR組2.2±1.3 8.3±3.0 12.6±4.8

圖1 沙土鼠海馬CA1區(qū)再灌注3dTUNEL陽性細(xì)胞（×400）

表3 亞低溫對前腦缺血沙土鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Hsp70蛋白表達(dá)OD的影響（，n=6）

表3 亞低溫對前腦缺血沙土鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Hsp70蛋白表達(dá)OD的影響（，n=6）

5±1.18 IR組 1.82±0.98 14.45±5.65 18.83±4.82 10.33±3.51 4.63±2.22 HSH組 2.08±1.29 2.02±1.21 1.92±1.10 1.84±1.06 1.92±1.26 HIR組 1.98±1.25 11.90±4.54 27.34±5.50 21.50±6.34 2h 4h 1d 3d 5d SH組 2.15±0.97 1.73±0.99 2.01±1.15 2.20±1.15 1.8組別11.22±3.58

圖2 沙土鼠海馬CA1區(qū)再灌注3dHsp70免疫染色（×200，LEICA Qwin圖像處理照片）

3 討 論

開闊法迷宮是一種反映動物行為的實(shí)驗(yàn)方法，海馬功能受損后動物空間定位和學(xué)習(xí)記憶能力下降，探索活動增加。本實(shí)驗(yàn)中前腦缺血5min沙土鼠再灌注5d內(nèi)，各時間點(diǎn)爬行格子數(shù)均多于對應(yīng)的SH組，給予亞低溫處理4h后，其爬行格子數(shù)明顯減少。神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注后死亡的重要方式之一是凋亡，本實(shí)驗(yàn)中亞低溫減少了沙土鼠腦缺血再灌注后CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)。

90年代中后期，江基堯等［5］將28～35℃輕中度低溫定義為亞低溫，發(fā)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)性腦缺血和顱腦外傷給予亞低溫治療，可以產(chǎn)生明確的神經(jīng)保護(hù)作用。隨后亞低溫治療這一概念被廣泛引用，并逐漸應(yīng)用于臨床。亞低溫可以通過降低缺血后腦細(xì)胞代謝、減少細(xì)胞能量的消耗、降低興奮性氨基酸的釋放、減少鈣離子內(nèi)流、抑制炎癥反應(yīng)、降低血管的通透性等減輕腦損傷后的腦水腫、降低顱內(nèi)壓促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)［6-7］。近年來，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制涉及復(fù)雜的生物學(xué)級聯(lián)反應(yīng)。亞低溫可以通過抑制凋亡因子Bax、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的表達(dá)［8-9］，抑制絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路的磷酸化c-Jun N-末端蛋白激酶（p-JNK）的表達(dá)等通過多種途徑抑制神經(jīng)元的凋亡［3］，產(chǎn)生腦保護(hù)作用，但是沒有任何一個因素可以完全解釋由低溫所提供的腦保護(hù)作用，了解它的多方面的影響因素，可能揭示其重要的保護(hù)機(jī)制［10］。

正常情況下，Hsp70在細(xì)胞內(nèi)有穩(wěn)定的表達(dá)，并很快被降解，腦組織內(nèi) Hsp70的含量極少，在應(yīng)激狀態(tài)下，Hsp70的表達(dá)增加［11］，能夠防止各種應(yīng)激刺激損傷大腦。Hsp70可以通過維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能正常、促進(jìn)有害物質(zhì)如氧自由基等清除，減少神經(jīng)元凋亡等發(fā)揮腦保護(hù)作用［12-14］。

對于腦缺血后亞低溫對Hsp70的表達(dá)的影響，研究結(jié)果并不一致，張秀洲等［15］研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫減少Hsp70蛋白的表達(dá)，其不是通過誘導(dǎo)Hsp70的表達(dá)對腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)檢測顯示5min腦缺血引起海馬CA1區(qū)Hsp70表達(dá)明顯增加，以再灌注后第1天表達(dá)最多，4h亞低溫可使1d后的Hsp70表達(dá)顯著增加，和Terao等［16］，肇杰等［17］研究結(jié)果一致，但對于2h、4h亞組的表達(dá)沒有影響，提示亞低溫可能通過增加Hsp70表達(dá)，上調(diào)腦缺血再灌注后的內(nèi)源性保護(hù)作用產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

亞低溫處理4h，可以增加沙土鼠前腦缺血再灌注1d后海馬CA1區(qū)Hsp70的表達(dá)，改善其行為學(xué)表現(xiàn)，減少海馬凋亡細(xì)胞。

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