黃永紅，徐方云，呂農(nóng)華

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006；2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，南昌 330006）

水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）是跨膜水通道蛋白家族的重要成員之一，廣泛分布于分泌性腺體上皮組織和細(xì)胞，在體內(nèi)水平衡和腺體分泌等方面起著重要作用［1］。新近研究表明，AQP5在多種腫瘤組織細(xì)胞中呈異常表達(dá)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化［2］、影響腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移等參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［3］。因此，AQP5正成為腫瘤研究的新領(lǐng)域。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建人AQP5重組質(zhì)粒并將其導(dǎo)入人胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)AQP5基因的AGS細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究AQP5基因?qū)ξ赴盒员硇偷挠绊懙於▽?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株AGS為本研究所保種；pcDNA 3.1／myc-His質(zhì)粒為本院科研中心羅時(shí)文教授饋贈(zèng)；總RNA提取液（TRIzol）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒為北京TransGen公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectmine2000試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒及膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；兔抗人AQP5抗體為Abcam公司產(chǎn)品；鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體為Santa Cruze公司產(chǎn)品；遺傳霉素（G418）為 Merck公司產(chǎn)品；美國(guó)Invitrogen公司完成引物合成；北京諾賽基因公司完成基因測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 人AQP5真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中人AQP5的mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列：上游5′-GCGAT GAA GAA GGA GGT GTG CTC CGT-3′（BamHⅠ）；下游5′-CCGTCA GCG GGT GGT CAG CTC C-3′（EcoRⅠ），下劃線示酶切位點(diǎn)（BamHⅠ、EcoRⅠ）。用PCR法擴(kuò)增獲得AQP5目的片段，產(chǎn)物長(zhǎng)度為810bp。對(duì)擴(kuò)增的AQP5基因片段和載體pcDNA3.1／myc-His分別用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳（110V，35min），電泳片段用凝膠回收試劑盒回收。AQP5目的片段與線性載體分別按摩爾比3∶1、6∶1和9∶1用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞后，接種于含氨芐西林100μg／mL的Lu-ria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基平板，37℃篩選過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。將酶切鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送北京諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL，接種于12孔培養(yǎng)板，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨機(jī)分為對(duì)照組、空載體組和AQP5轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染前棄含血清雙抗培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗2遍后，每孔加無(wú)血清無(wú)雙抗Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）1mL，將質(zhì)粒（μg）和Lipofectmine 2 000（μL）按1∶3的比例分別用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)髯暂p輕混勻靜置5min后，再混合兩者靜置20min，將混合液均勻加至相應(yīng)的細(xì)胞中，于37℃CO2孵育箱中培養(yǎng)5h后更換10%胎牛血清含青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 G418篩選濃度的確定及AGS細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選將AGS細(xì)胞以5×104／mL密度接種于12孔培養(yǎng)板中，24h后，將G418與含血清的DMEM培養(yǎng)基混合，配成濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和 1 000mg／L 的液體，每隔3d換液一次，培養(yǎng)10d，以10d90%細(xì)胞致死量為最佳篩選濃度，因此確定400mg／L為最佳篩選濃度。轉(zhuǎn)染24 h后按1∶10傳代于24孔板，細(xì)胞貼壁后加入含400mg／L G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14d至篩選出陽(yáng)性克??；挑取陽(yáng)性克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞株分別命名為AGS／AQP5細(xì)胞（轉(zhuǎn)染AQP5的細(xì)胞）和AGS／EV細(xì)胞（轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞），用200mg／L G418維持培養(yǎng)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞AQP5mRNA表達(dá) TRIzol法抽提AGS（對(duì)照組）、AGS／AQP5（AQP5 組）和 AGS／EV（空載組）細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AQP5引物序列：上游5′-CTT CCT CAA GGC CGT GTT C-3′；下游 5′-CTC CTC CCA GTC CTC GTC A-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′；下游5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7min。取10μL PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析進(jìn)行分析，以目的條帶AQP5與β-actin灰度值的比值反映AQP5mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞AQP5蛋白表達(dá) 收集對(duì)照組、AQP5組和空載組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。取總蛋白50μg／孔在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）40V，30 min后改電壓為80V，120min后至溴酚藍(lán)跑至膠最下方取膠，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，25V90min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉含0.1%葉吐溫20Tris緩沖溶液（TBST）4℃封閉60min；加入一抗孵育（AQP5 1∶500，β-actin 1∶500）4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，10min／次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（1∶5 000）孵育，4℃5h，洗膜，曝光、顯影、定影。Gel-pro凝膠成像分析軟件分析AQP5蛋白和β-actin蛋白的灰度值，并計(jì)算其比值反映AQP5蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 克隆的雙酶切及序列測(cè)定 重組質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖電泳約在810bp和5 480bp附近分別見(jiàn)一明顯條帶，與目的片段大小相符，見(jiàn)圖1，北京諾賽基因公司測(cè)序結(jié)果與GenBank中人AQP5（NM＿001651.2）的核苷酸序列完全一致。

圖1 酶切鑒定電泳圖

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組AGS細(xì)胞AQP5mRNA的表達(dá)

圖3 Western Blot檢測(cè)各組AGS細(xì)胞AQP5蛋白的表達(dá)

2.2 AQP5mRNA的表達(dá) 外源AQP5轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，AQP5mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，AQP5組與對(duì)照組、空載組比較，AQP5mRNA水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組與空載組比較mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.355），見(jiàn)圖2。

2.3 AQP5蛋白的表達(dá) 外源AQP5轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，AQP5蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，AQP5組與對(duì)照組、空載組比較，AQP5蛋白水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組與空載組比較蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.181），見(jiàn)圖3。

3 討 論

水的微環(huán)境是細(xì)胞內(nèi)外一切生命活動(dòng)進(jìn)行的場(chǎng)所，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也離不開(kāi)水的微環(huán)境。而且，腫瘤細(xì)胞為了滿足快速增殖、分裂及向周?chē)|(zhì)侵襲和轉(zhuǎn)移的需要，一系列酶的活性和表達(dá)發(fā)生改變，細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)成分合成明顯加強(qiáng)；同時(shí)癌細(xì)胞向周?chē)|(zhì)侵襲和進(jìn)出血管／淋巴管時(shí)需要體積和外形發(fā)生相應(yīng)改變［4］。因此，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞更需要水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

近年文獻(xiàn)報(bào)道AQP5蛋白過(guò)度表達(dá)于多種腫瘤組織中［5-8］，并與某些腫瘤的進(jìn)展、化療藥物的耐受及患者的預(yù)后相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，AQP5參與腫瘤生物學(xué)行為的形成。Chae等［9］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AQP5的K562細(xì)胞和LAMA84細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。Chen等［10］采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默 AQP5基因表達(dá)可明顯減少人肺癌細(xì)胞株SPC-A1細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且認(rèn)為其遷移和侵襲能力下降與沉默AQP5基因，降低細(xì)胞水的通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞大小和形態(tài)有關(guān)。Jung等［11］在乳腺癌研究中亦發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞MCF7AQP5表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。Chae等［7］的研究表明，外源性表達(dá)AQP5的正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B可發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），細(xì)胞呈成纖維樣改變，失去細(xì)胞-細(xì)胞間連接和細(xì)胞極性，而且細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)則上調(diào)，提示AQP5可通過(guò)EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明AQP5過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)荷瘤動(dòng)物腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移［12］。目前病理組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［13-14］，正常胃黏膜組織中AQP5呈低表達(dá)，而胃癌組織中AQP5呈高表達(dá)，提示AQP5可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展。但是，AQP5基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中究竟發(fā)揮何種作用，有待深入研究。

總之，本研究通過(guò)Western Blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)已成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源性人AQP5基因的AGS胃癌細(xì)胞株，這為進(jìn)一步研究AQP5基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能扮演的角色奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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