羅偉生，歐士鈺，靳雅玲，覃 浩，孫旭銳，喻 勤，傅向陽(yáng)

（1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西桂林 541001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，南寧 530001）

肝纖維化是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的病理過(guò)程，是各種慢性肝病進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段［1-2］。目前認(rèn)為，肝纖維化乃至早期肝硬化均可逆［3］。因此，對(duì)肝纖維化的防治具有重要意義。荔枝為廣西東南部特產(chǎn)，其核仁作為廣西特色中藥已有幾千年的應(yīng)用歷史。荔枝核總黃酮（total flavone from Litchi chinensis Sonn，TFL）是從荔枝核提取的有效藥理成分。實(shí)驗(yàn)研究表明，TFL可通過(guò)促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化作用［4］。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步觀察TFL抗肝纖維化作用，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)采用40只健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，質(zhì)量（200±20）g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK桂2007-0001）。主要試劑及藥品：丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factors-kappa B，NF-κB）多克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)二抗試劑、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-Diaminobenzidine，DAB）顯色購(gòu)于福建邁新生物科技有限公司；秋水仙堿-二甲基亞硝胺（DMN）購(gòu)于Sigma公司；TFL購(gòu)于廣州廣弘中藥材公司，經(jīng)鑒定為無(wú)患子科植物荔枝的成熟種子，桂林醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提取分離，荔枝核總黃酮含量達(dá)54.2%，用蒸餾水稀釋為40g／L溶液。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、TFL給藥組、秋水仙堿組，每組10只。正常對(duì)照組以等體積的生理鹽水灌胃。模型組、TFL給藥組、秋水仙堿組按Ala-Kokko等方法腹腔注射0.5%DMN制作肝纖維化模型［5］。造模與給藥同時(shí)。模型組、TFL給藥組、秋水仙堿組分別用5 mL／kg生理鹽水、200mg·kg-1·d-1TFL及0.1mg·kg-1·d-1秋水仙堿灌胃［4］，每日1次，共6周。6周后處死大鼠，抽取下腔靜脈血，常規(guī)分離血清，取部分肝臟組織加冷生理鹽水制成10%肝組織勻漿，取同一部位新鮮肝臟組織固定于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液中1d，制作石蠟切片。大鼠處死前禁食不禁水24h。

1.2.2 血清及肝組織勻漿生化指標(biāo)檢測(cè) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行MDA、SOD指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 肝組織病理學(xué)檢查 蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin staining，HE）染色、馬松染色按常規(guī)方法進(jìn)行。纖維化分級(jí)評(píng)分參照2002年中華肝臟病學(xué)會(huì)肝纖維化分級(jí)法進(jìn)行膠原纖維增生程度半定量分析［6］，最低0分，最高29分；得分越高，表示纖維化程度越重。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá) 防脫切片經(jīng)過(guò)常規(guī)脫蠟、脫水；2% 乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）高溫修復(fù)20min冷卻后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗；3%過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）阻斷10min，PBS沖洗；滴加NF-κB多克隆抗體（1∶200），1h后PBS洗；滴加二抗，15min后PBS沖洗；DAB顯色；蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。NF-κB p65采用半定量計(jì)分方法，以細(xì)胞核或胞漿呈棕黃色為（＋）。參照免疫組化顯色標(biāo)準(zhǔn)［7］：按顯色程度分弱、中、強(qiáng)3種，分別記以1、2、3分。每個(gè)指標(biāo)的每個(gè)標(biāo)本，取10個(gè)較好的高倍視野，按顯色范圍分為4度：＋為顯色范圍占高倍視野小于25%；＋＋為顯色占高倍視野25%～50%；＋＋＋為顯色占高倍視野＞50%～75%；＋＋＋＋為顯色占高倍視野大于75%。將每個(gè)高倍視野顯色程度和范圍換算成顯色指數(shù)，顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍（＋為1分、＋＋為2分、＋＋＋為3分、＋＋＋＋為4分），取其均數(shù)作為每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的最終顯色指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有4只大鼠死亡，尸檢及肝臟HE染色檢查，死因均為急性肝衰竭，死亡動(dòng)物不計(jì)入統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.2 TFL對(duì)肝纖維化大鼠血清AST、ALT水平的影響 模型組AST、ALT水平最高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TFL給藥組、秋水仙堿組ALT、AST水平明顯低于模型組（P＜0.05）。TFL給藥組ALT、AST與秋水仙堿組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 TFL對(duì)各組大鼠血清AST、ALT水平的影響（）

表1 TFL對(duì)各組大鼠血清AST、ALT水平的影響（）

＊：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與模型組比較；△：P＜0.05，與秋水仙堿組比較。

組別 n ALT（U／L） AST（U／L）10 45.45±11.05 84.95±14.50模型組 8 194.63±22.86＊ 293.99±23.78＊TFL給藥組 9 109.78±18.69＊?！?156.50±26.29＊?！髑锼蓧A組 9 147.11±27.29＊＃ 213.83±31.53＊＃正常對(duì)照組

2.3 TFL對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MDA、SOD的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織MDA含量顯著升高，SOD含量明顯減低（P＜0.05）。與模型組比較，TFL給藥組大鼠肝組織MDA的含量明顯降低，SOD含量顯著升高（P＜0.05）。TFL給藥組與秋水仙堿組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示：TFL能顯著降低DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中MDA含量，升高SOD含量。見(jiàn)表2。

表2 TFL對(duì)各組大鼠肝組織MDA、SOD的影響（）

表2 TFL對(duì)各組大鼠肝組織MDA、SOD的影響（）

＊：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與模型組比較；△：P＞0.05，與秋水仙堿組比較。

組別 n MDA（nmol／mg） SOD（U／mg）10 6.19±1.35 345.30±20.02模型組 8 15.08±2.93＊ 242.73±48.32＊TFL給藥組 9 8.54±1.96＊＃△ 286.68±30.15＊?！髑锼蓧A組 9 8.64±2.30＊＃ 276.60±29.26＊＃正常對(duì)照組

2.4 肝組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 光鏡觀察，與正常對(duì)照組相比，模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞水腫，脂肪變性，增生纖維分割、包繞肝小葉，多數(shù)正常小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失，匯管區(qū)周圍粗大膠原沉積，纖維隔內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。TFL給藥組和秋水仙堿組HE、馬松染色均顯示肝細(xì)胞水腫及變性不明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，膠原纖維增生較少，纖維疏松變窄，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。見(jiàn)圖1、表3。

2.5 免疫組化NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果 正常肝組織NF-κB呈弱陽(yáng)性表達(dá)，分布在匯管區(qū)、竇周及少數(shù)肝細(xì)胞中，顯色淡；模型組NF-κB呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與正常對(duì)照組比較表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），主要表達(dá)于匯管區(qū)和纖維間隔及肝細(xì)胞中，顯色最深呈棕黃色；TFL給藥組NF-κB蛋白表達(dá)與模型組比較明顯下降（P＜0.05），顯色較淡；秋水仙堿組NF-κB蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05）。TFL給藥組與秋水仙堿組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

圖1 各組肝組織光鏡檢查（HE×100）

圖2 各組肝組織NF-κB蛋白的表達(dá)（×400）

表3 各組肝組織纖維化評(píng)分及NF-κB表達(dá)情況（）

表3 各組肝組織纖維化評(píng)分及NF-κB表達(dá)情況（）

＊：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與模型組比較；△：P＜0.05，與秋水仙堿組比較。

組別 n 10 0.80±0.42 1.40±0.70模型組 8 21.13±5.46＊ 9.00±2.51＊TFL給藥組 9 6.78±3.93＊?！?4.11±2.26＊?！髑锼蓧A組 9 15.67±5.74＊＃ 6.44±2.74＊＃纖維化評(píng)分 顯色指數(shù)正常對(duì)照組

2.6 肝纖維化評(píng)分與 MDA、SOD、NF-κB相關(guān)性分析 肝組織病理學(xué)肝纖維化評(píng)分與 MDA、NF-κB呈正相關(guān)（r=0.72，0.66），與SOD呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中，作者采用DMN建造大鼠肝纖維化模型研究TFL抗肝纖維化的作用機(jī)制。DMN誘導(dǎo)的肝纖維動(dòng)物模型，與人類肝硬化早期改變的膠原沉積特點(diǎn)相似，DMN是一種肝毒性化合物，一方面可在線粒體中代謝為乙醛，進(jìn)而與蛋白質(zhì)交聯(lián)；另一方面DMN代謝產(chǎn)生活性甲基化基因，引起核酸、蛋白質(zhì)的甲基化，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死與肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，刺激HSC活化與膠原基因表達(dá)，導(dǎo)致肝纖維化。

脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是連結(jié)組織損傷與纖維化兩個(gè)過(guò)程的紐帶，抑制過(guò)氧化反應(yīng)，不僅可促進(jìn)肝損傷修復(fù)，而且也可防止纖維化的發(fā)生和發(fā)展［8］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織有較多的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，肝索排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生纖維間隔形成，提示大鼠肝纖維化模型復(fù)制成功。TFL防治干預(yù)6周后，血清ALT、AST、MDA含量明顯降低，SOD水平明顯升高，肝組織損傷程度呈好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，肝細(xì)胞壞死減少，病理學(xué)檢查肝纖維化程度明顯改善。結(jié)果提示，TFL有較好的保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能及抗肝纖維化作用，其機(jī)制可能與其提高SOD活性，降低MDA含量，清除氧自由基，保護(hù)肝細(xì)胞，抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。

NF-κB是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，普遍存在于多種組織的多種細(xì)胞中。研究表明，靜止的HSC向活化的HSC轉(zhuǎn)化時(shí)，NF-κB的結(jié)合活性增加，在細(xì)胞受到病毒、細(xì)菌毒素感染、缺血缺氧、組織損傷等各種因素作用下NF-κB活化，進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞黏附分子NOS和環(huán)氧化酶-2等基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致促炎因子、自由基、前列腺素等炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生，從而引起相應(yīng)病變，并同時(shí)以自分泌或旁分泌的形式激活未活化枯否細(xì)胞中的NF-κB，產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì)，形成“炎性瀑布”，造成肝臟炎癥反應(yīng)，激活HSC參與肝臟纖維化進(jìn)程［9-10］。而且NF-κB還具有抗 HSC凋亡的作用，使得活化的HSC的數(shù)量維持在一定的水平，一定程度上促進(jìn)了纖維化的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。因此，抑制NF-κB的表達(dá)和增殖，可以作為抗肝纖維化治療的有效途徑之一［13-14］。

在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組NF-κB呈弱陽(yáng)性表達(dá)，模型組強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而運(yùn)用TFL及秋水仙堿處理后治療組肝組織NF-κB的表達(dá)明顯減弱，表明NF-κB參與了DMN誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)程。模型組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)為廣泛纖維組織增生假小葉形成；而采用TFL處理后TFL組肝組織NF-κB活性顯著下降，病理學(xué)顯示其纖維化程度較模型組明顯改善，僅見(jiàn)少量纖維間隔及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)肝硬化形成。相關(guān)性分析表明，NF-κB在肝內(nèi)表達(dá)的增強(qiáng)程度與病理學(xué)上纖維化程度評(píng)分呈一定正相關(guān)，提示TFL抗肝纖維化作用可能與其下調(diào)NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制HSC活化、促進(jìn)活化的HSC凋亡有關(guān)。

綜上所述，TFL對(duì)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化具有較好的防治作用，其機(jī)制可能與減輕機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、抑制NF-κB的高表達(dá)有關(guān)。然而TFL抗肝纖維化的具體體內(nèi)生物過(guò)程尚有待進(jìn)一步研究。

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