劉海平，趙學(xué)凌，吳雪梅，李興國，鄭宏宇

（昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，昆明 650032）

深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）因其并發(fā)致命性的肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）及難治性的靜脈血栓后遺癥（postthrombotic syndrome，PTS）而引起臨床、科研的極大關(guān)注［1］。在DVT到PTE、PTS過程中，血栓栓子的溶解、再通成為影響DVT預(yù)后的決定因素［2］。研究發(fā)現(xiàn)，與機(jī)體損傷修復(fù)過程相似，血栓形成后，單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞在各種趨化因子的誘導(dǎo)下聚集于血栓形成部位，參與栓子的溶解過程［3-4］。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflamma-tory protein 1α，MIP-1α）因其較強(qiáng)的趨化單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞作用而逐漸引起重視［5］。本研究擬在建立小鼠DVT模型的基礎(chǔ)上觀察血栓形成后MIP-1α的表達(dá)及其與血栓溶解的關(guān)系，為臨床DVT的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 100只昆明種小鼠購買于成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（滇）2005-0008］，體質(zhì)量18～22g，雌雄不限，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［6］。Trizol試劑、SYBR＠Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒購買于大連寶生物工程有限公司，MIP-1αELISA試劑盒購于美國RB公司，MIP-1α中和抗體（300μg／mL）購于美國Peprotecch公司，Q／CYAE111-2000顯微手術(shù)器械購于上海醫(yī)療器械有限公司。

1.2 小鼠DVT模型的建立及分組 100只昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和模型組（n=90）。模型組以3%的戊巴比妥鈉（1mL／kg）麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，沿腹中線縱軸切2.0 cm切口，分離皮下組織至腹腔，將腹腔內(nèi)容物輕輕推向左側(cè)，暴露、分離下腔靜脈，結(jié)扎可視側(cè)支，神經(jīng)血管鉗鉗夾約1.0 cm長的近遠(yuǎn)端各30s，5-0聚丙烯縫線沿下腔靜脈縱軸放置，鉗夾段血管中段以4-0的絲線連同靜脈管壁及聚丙烯縫線結(jié)扎，隨后抽出聚丙烯縫線，制造狹窄管腔。逐層閉合切口，術(shù)后均未應(yīng)用任何抗生素，自由進(jìn)飲食。參照文獻(xiàn)［7-8］，將模型組分為2個(gè)亞組：DVT組（小鼠不加任何干預(yù)，n=45）和DVT＋MIP-1α-Ab組（小鼠造模后予以MIP-1α中和抗體0.5mL持續(xù)腹腔注射7d，n=45）；隨后各亞組于2、4、8、12、21d5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取8只小鼠過量麻醉處死，取靜脈壁及栓子進(jìn)行檢測。根據(jù)文獻(xiàn)［9］報(bào)道，以血栓栓子的質(zhì)量／長度比值觀察血栓溶解程度。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) cDNA制備：將小鼠過量麻醉處死后，冰盤上取靜脈及血栓組織50～100mg，立即放入Trizol試劑中進(jìn)行RNA抽提。以260nm及280nm吸光度值計(jì)算所獲RNA含量及純度，分裝后-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄過程按試劑盒說明書操作。PCR引物設(shè)計(jì)：MIP-1α引物設(shè)計(jì)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer 5.0程序設(shè)計(jì)，引物由上海生工公司合成。見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

PCR 過程：SYBR＠Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL、MIP-1α／GAPDH 上游引物（10pmol／L）1μL、MIP-1α／GAPDH 下游引物（10pmol／L）1μL、模板cDNA 2μL、dd H2O 8.5μL（總體積25μL）于PCR反應(yīng)管中，擴(kuò)增條件如下：（1）95℃3min預(yù)變性；（2）95℃20s變性，60℃30s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析：分別測定每個(gè)樣品 MIP-1α和GAPDH mRNA的Ct值，每個(gè)樣品均作復(fù)孔以減少操作誤差。Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。采用相對(duì)定量方式表示各樣品 MIP-1α的ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。再依據(jù)ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt參照基因，計(jì)算2-ΔΔCt。當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，2-ΔΔCt表示所檢測樣品相對(duì)于作為參照因子樣品的目的基因的表達(dá)倍數(shù)。對(duì)PCR反應(yīng)過程中的每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，根據(jù)擴(kuò)增曲線確定Ct值，利用2-ΔΔCt法計(jì)算MIP-1αmRNA相對(duì)拷貝數(shù)。

1.4 ELISA檢測下腔靜脈及血栓組織中MIP-1α表達(dá) 取10 g靜脈及血栓樣品勻漿化，稱取3g勻漿化組織樣品，轉(zhuǎn)至玻管中，加6mL乙酸乙酯充分混合10min，2 000r／min離心10 min，隨后4mL乙酸乙酯加入玻管中，在50℃溫和氮流下蒸發(fā)掉乙酸乙酯。將殘留物溶于1mL正己烷中，再加入1mL稀釋緩沖液，渦旋混合1min，2 000～3 000r／min離心10min，如上層發(fā)生乳化，可將試管50℃水浴5min后再次3 000r／min離心，移取50μL（2g組織／mL）用于檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測3次，使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況 模型組有1只小鼠因嚴(yán)重感染死亡，89只用于實(shí)驗(yàn)。所有小鼠于建模后2d解剖觀察，模型組造模段靜脈均有血栓形成，管壁暗紅，輕壓不癟。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及ELISA檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，DVT組MIP-1αmRNA、蛋白隨時(shí)間點(diǎn)的改變呈逐漸升高趨勢，8d升至最高點(diǎn)（P＜0.05），后呈逐漸下降趨勢，DVT＋MIP-1α-Ab組 MIP-1αmRNA、蛋白表達(dá)亦呈上述趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），相同時(shí)間點(diǎn)DVT組 MIP-1αmRNA、蛋白變化較為明顯（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各亞組不同時(shí)間點(diǎn)MIP-1αmRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.3 血栓栓子質(zhì)量／長度比值 造模后各亞組于2、4、8、12、21d5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死8只小鼠，切取造模段血管，結(jié)果顯示DVT組及DVT＋MIP-1α-Ab組栓子質(zhì)量／長度比值隨時(shí)間的延長呈逐漸縮小的趨勢（P＜0.05），相同時(shí)間點(diǎn)DVT組血栓栓子質(zhì)量／長度比值減小更為明顯（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各亞組不同時(shí)間點(diǎn)血栓質(zhì)量／長度比值

3 討 論

小鼠DVT模型的建立及血栓溶解規(guī)律DVT因其較高的發(fā)病率、病死率深受外科領(lǐng)域的關(guān)注［10］。在本研究中，參照文獻(xiàn)報(bào)道由神經(jīng)血管鉗鉗夾聯(lián)合結(jié)扎下腔靜脈建立小鼠DVT模型，符合靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及靜脈血流淤滯的條件。在實(shí)驗(yàn)中作者觀察到建模后小鼠DVT在2d內(nèi)形成，提示在急性靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及靜脈血流淤滯的條件下，2d內(nèi)機(jī)體對(duì)損傷處于強(qiáng)烈應(yīng)激狀態(tài)，這種強(qiáng)烈反應(yīng)狀態(tài)易誘發(fā)病理性血栓形成過程；在本次研究中，模型組小鼠于血栓形成后栓子隨時(shí)間的延長而呈逐漸縮小的趨勢，2周后栓子基本無變化，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［11］。

研究發(fā)現(xiàn)，DVT的溶解、機(jī)化、再通過程取決于3個(gè)因素：局部靜脈微環(huán)境中纖溶系統(tǒng)的激活，靜脈壁、血栓栓子中基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的活性，血栓栓子中血管新生情況［12］?，F(xiàn)已得到共識(shí)：DVT形成及溶解、機(jī)化、再通是一個(gè)炎癥及免疫反應(yīng)參與的過程，與機(jī)體組織的損傷修復(fù)過程類似，DVT的溶解、機(jī)化、再通過程伴隨著中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的活化、遷移、浸潤，表達(dá)各種細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-γ等，這些炎性／免疫細(xì)胞因子可活化影響血栓栓子溶解、再通的下游調(diào)控基因u-PA、MMPs等，從而促進(jìn)血栓栓子的溶解、再通［13-14］。

MIP-1α是趨化因子C-C家族成員，主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，局部組織中產(chǎn)生的MIP-lα能特異性地趨化淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞向炎癥、損傷部位遷移，促進(jìn)損傷部位的自我修復(fù)過程［15］。Chen等［16］在大鼠DVT模型造模后腹腔注射rh G-CSF后發(fā)現(xiàn)，血栓栓子中MIP-1α、MCP-1在栓子中呈逐漸升高趨勢，同時(shí)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在術(shù)后3d顯著升高，與血栓栓子縮小程度相一致，這提示MIP-1α在DVT溶解中起重要作用。

在本研究中作者觀察到，DVT組造模段靜脈及其血栓栓子中的MIP-1αmRNA、蛋白隨時(shí)間點(diǎn)的改變呈逐漸升高趨勢，8d升至最高點(diǎn)（P＜0.05），后呈逐漸下降趨勢；同時(shí)，血栓栓子的質(zhì)量／長度比值亦隨時(shí)間點(diǎn)的改變而呈逐漸縮小趨勢；在應(yīng)用 MIP-1α中和抗體腹腔注射后，DVT＋MIP-1α-Ab組MIP-1αmRNA、蛋白表達(dá)雖呈上述趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)DVT組血栓栓子質(zhì)量／長度比值減小較DVT＋MIP-1α-Ab組更為明顯（P＜0.05）。提示 MIP-1α在DVT形成后參與了栓子的溶解過程，MIP-1α中和抗體可阻滯其溶解血栓的作用。

值得注意的是，在血栓形成后 MIP-1αmRNA、蛋白的表達(dá)在8d左右達(dá)到高峰，而栓子的質(zhì)量／長度比值呈逐漸下降的趨勢，這提示在血栓栓子溶解過程中還有其他參與因素，MIP-1α的作用主要表現(xiàn)在血栓形成后2周內(nèi)。分析后作者認(rèn)為，在血栓形成后，局部靜脈微環(huán)境處于損傷應(yīng)激狀態(tài)，此時(shí)中性粒細(xì)胞／巨噬細(xì)胞在MIP-1α等趨化因子的誘導(dǎo)下遷徙到血栓形成部位，參與局部靜脈的損傷修復(fù)；在1～2周后，栓子的溶解、縮小主要為血栓再通作用引起。

在本研究中作者通過建立小鼠下腔靜脈DVT模型觀察MIP-1α與血栓溶解之間的關(guān)系，進(jìn)而應(yīng)用MIP-1α中和抗體明確其促進(jìn)血栓溶解的作用；在實(shí)驗(yàn)中未能進(jìn)一步明確其促進(jìn)血栓溶解的確切機(jī)制，有待于下一步研究。

［1］Heit JA.The epidemiology of thromboembolism in the community［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（3）：370-372.

［2］Sakuma M，Nakamura M，Yamada N，et al.Venous thromboembolism：deep vein thrombosis with pulmonary embolism，deep vein thrombosis alone，and pulmonary embolism alone［J］.Circ J，2009，73（2）：305-309.

［3］Günzl P，Bauer K，Hainzl E，et al.Anti-inflammatory properties of the PI3Kpathway are mediated by IL-10／DUSP regulation［J］.Leukoc Biol，2010，88（6）：1259-1269.

［4］Henke PK，Wakefield T.Thrombus resolution and vein wall injury：dependence on chemokines and leukocytes［J］.Thromb Res，2009，123（Suppl 4）：S72-S78.

［5］Yuan Y，Li P，Ye J.Lipid homeostasis and the formation of macrophage-derived foam cells in atherosclerosis［J］.Protein Cell，2012，3（3）：173-181.

［6］中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見［EB／OL］.（2006-09-30）［2011-06-15］.http：／／www.most.gov.cn／fggw／zfwj／zfwj2006／200609／t20060930＿54389.htm.

［7］Humphries J，Gossage JA，Modarai B，et al.Monocyte urokinase-type plasminogen activator up-regulation reduces thrombus size in a model of venous thrombosis［J］.J Vasc Surg，2009，50（5）：1127-1134.

［8］莫建文，黃河，張春強(qiáng)，等.創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成中補(bǔ)體相關(guān)基因表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2008，3（28）：244-246.

［9］Henke PK，Varga A，De S，et al.Deep vein thrombosis resolution is modulated by monocyte CXCR2-mediated activity in a mouse model［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（6）：1130-1137.

［10］鄧姝.預(yù)防關(guān)節(jié)置換術(shù)后深靜脈血栓的管理措施［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（10）：969-970.

［11］李玉林.病理學(xué)［M］.7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：608.

［12］Hallevi H，Walker KC，Kasam M，et al.Inflammatory response to intraventricular hemorrhage：time course，magnitude and effect of t-PA［J］.J Neurol Sci，2012，315（1／2）：93-95.

［13］Wakefield TW，Henke PK.The role of inflammation in early and late venous thrombosis：are there clinical implications［J］.Semin Vasc Surg，2005，18（3）：118-129.

［14］張利，張永川，趙渝.深靜脈血栓形成后綜合征研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（11）：1123-1125.

［15］Smits HA，Rijsmus A，van Loon JH.Amyloid-beta-induced chemokine production in primary human macro-phages and astroeytes［J］.J Neurolrnrnunol，2002，127（1／2）：160-168.

［16］Chen YK，Jiang XM，Gong JP.Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor enhanced the resolution of venous thrombi［J］.J Vasc Surg，2008，47（5）：1058-1065.