袁明生，唐富英，王 影

（1.廣東醫(yī)學院附屬陳星海醫(yī)院 檢驗科，廣東 中山528415；2.廣東省醫(yī)學院附屬陳星海醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 中山528415）

近年來，基因技術(shù)、蛋白質(zhì)組學、腫瘤免疫等方面的研究飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一系列新的潛在的腫瘤標志物，高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）被認為是最值得期待的肝癌血清標志物之一，GP73診斷原發(fā)性肝癌的作用已得到肯定［1－4］。本研究對GP73酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測人血清中GP73濃度的方法學進行了評價，茲報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ELISA法檢測GP73試劑盒 由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供，批號：20120101。其原理是雙抗體夾心ELISA法定量檢測血清或血漿樣品中GP73含量：酶標板上預(yù)包被抗GP73單抗，可與樣品中GP73反應(yīng)結(jié)合，配合加入HRP標記GP73多抗，然后用TMB底物作用顯色，顯色強度與樣品中GP73濃度成正比。通過酶標儀檢測吸光度（OD值），按照GP73校準品制定濃度曲線（標準品濃度：0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml、500ng/ml），使用線性擬合方式，通過標準曲線計算樣品中GP73的含量。試劑盒有效期為9個月，96人份/盒。

1.1.2 儀器 安圖iWO－960洗板機、安圖2010酶標儀

1.2 方法

1.2.1 GP73測定 血清GP73測定嚴格按試劑說明書操作，安圖2010酶標儀比色，并自動繪制標準曲線，計算出樣品濃度。試劑盒說明書的參考范圍：GP73＜150ng/ml，患肝癌風險率低。

1.2.2 線性范圍 將北京熱景生物技術(shù)有限公司提供的 GP73標準液0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500ng/ml用此試劑盒按測定方法進行測定，所得結(jié)果取吸光度和濃度后用Excel軟件繪制線性圖。

1.2.3 準確度評價 選用四個濃度，連續(xù)測5天，根據(jù)測定結(jié)果與理論值之間的差異來計算偏倚與相對偏倚。偏倚值＝實測濃度－理論濃度；相對偏倚＝｜實測濃度－理論濃度｜/理論濃度×100%。

1.2.4 精密度評價 取兩種濃度的標準品用GP73試劑盒按測定方法測定，連測20天，所取結(jié)果計算變異系數(shù)（CV）。

1.2.5 回收試驗 選已用本法測定的含量分別為78.9ng/ml和176.1ng/ml血清標本，分別加入等體積的濃度為70ng/ml的標準品，混勻后再用本法進行測定，計算回收率，回收率＝回收濃度/加入濃度×100%。

1.2.6 臨床標本測定 選取我院2010年1月至2012年3月住院病人（排除了其它系統(tǒng)惡性腫瘤和嚴重疾?。┕?20例，其中肝癌組40例（經(jīng)住院手術(shù)或肝穿病理檢查確診原發(fā)性肝癌患者），肝病組40例（慢性肝炎20例、肝硬化20例），對照組40例（門診除孕婦外的健康成年體檢者）。所有肝癌患者和肝硬化患者和對照組人群肘正中靜脈取血于真空管中，靜置30min，在相對離心力3130×g離心5min后，分離后的血清標本放入－20℃冰箱保存待統(tǒng)一檢測GP73濃度。以上所有標本均嚴格按試劑說明書操作測定GP73。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。兩變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，一致性采用Kappa，評價診斷實驗的指標用靈敏性、特異性、符合率和陰、陰預(yù)測值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍

GP73標準液0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500ng/ml用此試劑盒按測定方法進行測定，所得結(jié)果取吸光度和濃度后繪制標準曲線，縱坐標（Y）為標準濃度，橫坐標（X）為吸光度（OD）值，見圖1。方程為Y＝427.2X－5.05，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.998（P＝0.000）

2.2 準確度

濃度為70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500 ng/ml的GP73標準液按測定方法進行測定，連測5天，偏倚均＜5ng/ml，相對偏倚均在10%范圍內(nèi)。見表1。

2.3 精密度

取70ng/ml和180ng/ml濃度的標準品用GP73試劑盒按測定方法各測20次，計算的CV值分別為11.0%和8.9%，均少于15.0%。

圖1 ELISA法GP73標準曲線

表1 GP73試劑盒測定偏倚結(jié)果

2.4 回收試驗

選已用本法測定的含量分別為78.9ng/ml和176.1ng/ml血清標本200μl，分別加入等體積的濃度為70ng/ml的標準品，混勻后再用本法進行測定，測量的結(jié)果及計算得到的回收率見表2。

表2 回收試驗結(jié)果

2.5 方法學比較

以GP73＜150ng/ml作為診斷PHC界點與“金標準”病理結(jié)果比較見表3，兩者相關(guān)系數(shù)（r）＝0.76＞0.5，P＜0.05，兩種方法之間呈正相關(guān)性，相關(guān)關(guān)系較密切，Kappa＝0.533，在0.4～0.75之間，與病理診斷PHC結(jié)果有中度的一致性，此時GP73診斷HCC的敏感性為90.0%、特異性為70.0%、符合率為76.70%、陽性預(yù)測值為60.0%，陰性預(yù)測值為93.3%。

表3 GP73濃度與病理結(jié)果比較

3 討論

長期以來，肝癌無創(chuàng)傷的診斷主要是應(yīng)用血清腫瘤標志物結(jié)合影像學的方法。近年來，已有許多報道GP73是新發(fā)現(xiàn)的診斷原發(fā)性肝癌的的腫瘤標志物［5－6］。GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白，Block等［7］于2005年首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平顯著升高。其原因可能與肝癌患者肝細胞損傷有關(guān)或是與GP73維持高爾基體結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。細胞器的改變與人類癌的發(fā)生聯(lián)系密切，當細胞核和線粒體正常功能、結(jié)構(gòu)組成的被破壞時，反映了癌細胞在基因組和微環(huán)境上的改變，以適應(yīng)癌細胞的代謝需求［8］。

由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供的ELISA法檢測GP73試劑盒的標準曲線有較大的斜率（427.2）和一定的寬度，在0－500ng/ml的范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)為0.998，符合劑量反應(yīng)工作曲線的要求［9］；在測定范圍內(nèi)的偏倚均＜5ng/ml，相對偏倚均在10%，有較好的準確度；日間和批間、批內(nèi)各CV均＜11.0%，少于公認的15.0%，有良好的精密度；此外，還有良好的回收率（97.3%－103.5%），可以根據(jù)標準曲線能夠進行定量分析。

本次研究120例臨床標本測量結(jié)果與“金標準”病理結(jié)果對比研究發(fā)現(xiàn)，由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供的ELISA法檢測GP73試劑盒診斷原發(fā)性肝癌的敏感性和特異性分別是90.0%和70.0%，符合率為76.7%。與病理診斷PHC的結(jié)果比較，有中度的一致性，其符合率76.7%，雖然陽性預(yù)測值只有60.0%，但陰性預(yù)測值卻高達93.3%，GP73＜150ng/ml，患PHC的可能性接近5%。有報道［10－12］：GP73用于診斷肝癌效果明顯優(yōu)于 AFP，可以顯著提高對肝癌診斷的靈敏度和特異性。

綜上所述：GP73試劑盒診斷原發(fā)性肝癌的ELISA法既可定量檢測GP73濃度，又操作簡單、重復(fù)性好、結(jié)果容易判斷、價格低廉，無需特殊儀器和高標準的實驗條件，易于推廣應(yīng)用；既可作為AFP診斷PHC的補充，又具有獨立檢測價值。

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