許 方，李曉蘭，吳小利

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院 檢驗科，遼寧 大連116027；2.溫州醫(yī)學(xué)院研究生院，浙江 溫州325035）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于全球第4位，中國第2位［1］，也是我國癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因。由于大多數(shù)患者被確診時已是中晚期，因此HCC的早期診斷非常重要。AFP是目前最常用的腫瘤標(biāo)記物，但仍存在在分化程度好的HCC或退行發(fā)育的HCC可能僅有輕度或沒有升高，對于腫瘤直徑小于1cm的微小HCC的檢出率仍不高等問題。

GPC3是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰糖蛋白，它在絕大多數(shù)肝癌患者中表達(dá)，而在正常肝組織及良性肝臟病變中不表達(dá)或僅有微弱表達(dá)［2，3］。國外最新研究表明，GPC3可以作為一種新的肝癌腫瘤標(biāo)志物用于臨床研究。本研究通過對肝癌及肝硬化患者GPC3及AFP的檢測，探討血清GPC3對肝癌患者的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2010－2－1至2012－11－25到大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院就診的肝癌患者（符合 年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會指定的診斷標(biāo)準(zhǔn)）120例（其中男77例，年齡25－93歲；女43例，年齡23－81歲），肝硬化患者（符合2000年病毒性肝炎防治方案肝硬化的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)）32例（其中男19例，年齡33－79歲；女13例，年齡28－81歲）及正常對照組25例（其中男16例，年齡23－79；女9例，年齡38－79歲）。正常對照為排除各型肝炎及其他任何肝功能異常的健康體檢者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、處理 采集靜脈血標(biāo)本，分離血清，－20℃冷凍保存。

1.2.2 檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測標(biāo)本AFP值，儀器為Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光分析儀，試劑購自羅氏公司。ELISA方法測定標(biāo)本GPC3值，試劑購自Uscn公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)檢測儀型號為美國ElX800NB。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，均值用±s表示，組間比較采用t檢驗和方差分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GPC3和AFP的相關(guān)性采用相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同組別血清GPC3水平比較（表1）

肝癌患者血清中 GPC3值（22.014±36.930 ng/ml）高于肝硬化患者（8.590±8.171ng/ml）及正常對照（0.455±0.244ng/ml），HCC組 GPC3值與肝硬化組及正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 不同組別血清GPC3水平（±s）

表1 不同組別血清GPC3水平（±s）

＊P＜0.01，AFP與GPC3兩項數(shù)據(jù)HCC組與肝硬化組相比差異存在顯著性；＃P＜0.01，AFP與GPC3兩項數(shù)據(jù)HCC組與正常對照組相比差異存在顯著性；經(jīng)相關(guān)性分析，GPC3與AFP二者的相關(guān)系數(shù)為－0.13，P值為0.15，P＞0.05，二者之間沒有相關(guān)性。

組別 例數(shù) AFP（IU/ml） GPC3（ng/ml）HCC組 120 385.39±302.90＊＃ 22.014±36.930＊＃25 2.21±2.18 0.455±0.244肝硬化組 32 48.65±38.31 8.590±8.171正常對照組

2.2 GPC3、AFP單獨檢測和二者聯(lián)合檢測診斷HCC的敏感度和特異度比較（表2）

統(tǒng)計120例HCC組及32例肝硬化組，GPC3對肝癌診斷的敏感性略高于AFP，二者之間差異不存在顯著性（P＞0.05）；特異性則低于AFP，二者之間差異不存在顯著性（P＞0.05）；GPC3聯(lián)合AFP檢測HCC敏感性提高。

表2 GPC3、AFP和兩者聯(lián)合診斷HCC的敏感性和特異性比較

2.3 HCC組中GPC3在AFP陽性與陰性中的檢測結(jié)果（表3）

HCC組中，100例AFP陽性中有88例GPC3陽性，陽性率88.00%，20例AFP陰性中有15例GPC3陽性，陽性率75.00%。

表3 HCC組中GPC3在AFP陽性與陰性中的檢測結(jié)果

3 討論

1996年，Pilia等［4］發(fā)現(xiàn)一例過度生長綜合征的者存在x：1轉(zhuǎn)位，通過STSS－PCR得到分離克隆了一個cDNA，屬硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族家族，命名為磷脂酰肌醇蛋白聚糖－3（Glypican－3，GPC3）。GPC3蛋白作為一種膜性間質(zhì)蛋白，其表達(dá)方式與生長因子（如成纖維細(xì)胞生長因子等）及其受體表達(dá)方式一致，能通過一系列細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)的信號來調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和各種細(xì)胞行為如黏附、增殖、遷移、存活和分化。有研究證實其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)率為80%－100%，并且不依賴于肝細(xì)胞癌的分化和腫瘤大小，在肝腺瘤中無表達(dá)［5］。Yamauchi等［6］研究表明GPC3蛋白在肝癌組織中的高表達(dá)同基因水平相一致，在非肝癌組織中同樣沒有表達(dá)或表達(dá)量極低。Wang［7］等發(fā)現(xiàn)，約48%的高級別不典型增生結(jié)節(jié)或早期肝細(xì)胞癌GPC3陽性表達(dá)，3%的低級別不典型增生或良性結(jié)節(jié)陽性表達(dá)。

本實驗分析了25例正常人血清、32例肝硬化病人血清和120例原發(fā)性肝癌病人血清中的GPC3含量。結(jié)果表明：HCC組的GPC3明顯高于肝硬化組及正常對照組，說明GPC3對肝癌的診斷有一定意義。這一結(jié)果與許多國外學(xué)者的報道相吻合，如Hsu等［8］報道在154例肝癌組織中有74.8%檢測到GPC3mRNA，而在正常肝和肝炎組織中只有3.2% 能檢測得到。Hippo等［9］在肝癌病人血清中特異性地檢測到可溶GPC3（sGPC3），其表達(dá)量明顯高于肝硬化病人及健康對照組，且方法的敏感性優(yōu)于AFP。Nakatsura等［10，11］應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法發(fā)現(xiàn)40%－53%肝癌患者血清GPC3陽性，而在20例肝炎肝硬化患者血清中僅1例陽性，正常人血清中未檢測到。

在我們的研究中同時發(fā)現(xiàn)肝硬化組中有幾例GPC3＞20ng/ml，對此我們進(jìn)行了病例追蹤，追蹤到1例患者屬于在采樣時診斷為肝硬化但后來確診為肝癌，提示檢測GPC3有助于肝癌的早期發(fā)現(xiàn)，對肝癌的早期診斷具有一定意義，值得引起臨床的高度重視。

本研究也同時進(jìn)行了AFP的檢測，二者單獨檢測GPC3敏感性及特異性分別為85.83%、50%；AFP敏感性及特異性分別為83.33%、62.50%。即GPC3對肝癌的診斷敏感性要高于AFP，而特異性低于AFP，與一些學(xué)者的研究進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)我們的特異度偏低，而敏感度的結(jié)果與其相仿，如Coston等［12］檢測肝癌、肝腺癌、淋巴結(jié)增生患者和非肝癌的癌癥患者的GPC3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在107例肝癌中有94例（84%）能夠得到GPC3的陽性染色。GPC3對原發(fā)性肝癌的靈敏度和特異性分別達(dá)到88%和97%。靈敏度方面的一致性充分證明了GPC3這一指標(biāo)對肝癌診斷的價值。特異性方面的不同分析原因可能有以下幾點：首先因為我們采用的方法不同，多數(shù)學(xué)者采用PCR、免疫組化、病理技術(shù)及動物實驗方法，而本實驗采用ELISA方法；其次是ELISA試劑盒廠家不同，其檢測限、敏感性有所不同；另外在病例選取方面也存在差異，本研究在病例選取時多傾向于AFP較低或正常的患者，這些都有可能導(dǎo)致研究的結(jié)果的差異。

GPC3與AFP聯(lián)合檢測HCC的敏感性為95.83%，特異性為46.88%，敏感性有所提高，但在二者的相關(guān)分析中P＞0.05，顯示GPC3和AFP二者并無相關(guān)性，這也從另一個方面顯示出聯(lián)合檢測的價值，且與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。Tangkijvanich等［14］用免疫吸附測定血清GPC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53%的肝癌患者血清GPC3的水平在35.5－7826.6 ng/l，發(fā)現(xiàn)GPC3和 AFP的陽性率水平不相關(guān)。apurro和 Filmus［15、16］分別比較分析肝癌病人血清中GPC3和AFP的表達(dá)，結(jié)果顯示在同一病人血清中兩者沒有相關(guān)性，認(rèn)為兩者聯(lián)合檢測能夠顯著提高肝癌的早期診斷。

綜上我們認(rèn)為，GPC3在肝癌的早期篩查診斷方面具有一定的臨床意義，而聯(lián)合檢測GPC3和AFP可提高肝癌診斷的敏感性，防止漏檢。

［1］Yuen MF，Lai CL.Serological markers of liver cancer［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2005，19：91.

［2］Veugelers M，Cat BD，Muyldermans SY，et al.Mutation GPC3/GPCA glypican gene cluster on Xq 26in patients GolabiBehmel syndrome：identification of loss of uinthe GPC3gene［J］.Hum Mol Genet，2000，9：1321.

［3］Capurro M I，Xiang YY，Lobe C，et al.Glypican－3promotes thegrowth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical Wnt signaling［J］.Cancer Res，2005，65：6245.

［4］Pilia G，Hughes－Benzie RM，Mackenzie A，et al.Mutalations in GPC3，aglyicangenes cause the Simpson－Golabi－Behmel over growth syndrome［J］.Nature Genet，1996，12（3）：241.

［5］Come C.Magnino F，Bibeau F，et al.Snail and slugplay distinct rolesdur Ingbre ast carcinoma progression［J］.Clin Cancer Res，2006，2（1 8）：5395.

［6］Yamauchi N，Watanabe A，Hishinuma M，et al.The glypican－3 oncofetal pr otein is a promising diagnostic maker for hepatocellular carcinoma［J］.Mod Pathol，2005，18（12）：1591.

［7］Wang XY，Degos F，Dubois S，et a1.Glypiean－3expr ession in hepatacellular tulnoFs diagnostic value for preneoplasticlesions and hepatocellular carcinomas［J］.Hum Pathol，2006，3 7（11）：1435.

［8］Hsu HC，Cheng W.Lai PL Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7in hepatocellular carcinoma：biologicalsignificance and temporospatial distribution［J］.Cancer Res，1997，57：5179.

［9］Hippo Y，Watanabe K，Watanabe A，et al.Identification of soluble NH2－terminal fragment of glypican－3as a serological marker for early－stage hepat ocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2004，64（7）：2418.

［10］Nakatsura T，Yoshitake Y，Senju S，et al.Glypican－3，over expressed specifically in human hepatocellular carcinoma，is a novel tumor marker［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，306（1）：16.

［11］Capurro M，Wanless IR，Sherman M，et al.Glypican－3：A novel serumand histochemical marker for hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2003，125 （1）：89.

［12］Coston WM，Loera S，Lau SK，et al.Distinction of hepatocellularcarcinoma from benign hepatic mimickers using Glypican－3 andCD34immunohistochemistry［J］.Am J Surg Pathol，2008，32（3）：433.

［13］Ding GH，Wang HY，Chen H，et al.Expression of the glypican－3gene inα－fetoprotein－negative human hepatocellularcarcinoma［J］.The Chinese－German Journal of Clinical Oncology，2005，4（5）：262.

［14］Tangkijvanich P，Chanmee T，Komt ong S，et al.Diagnostic role ofserumlican3indifferentiatinheatocellularcarcinoma from non－malignant chr onic liver disease and other liver cancers［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25（1）：129.

［15］CapurroM，F(xiàn)ilmus J.Glypican－3as a serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2005，65（1）：372.

［16］Filmus J，CapurruoM.Glypican－3and alphafetoprotein as diagnostictests for hepatocellular carcinoma［J］.MolDiagn，2004，8（4）：20.