楊衛(wèi)軍，楊 霞，尹家俊，王亞?wèn)|，董浩林，吳正陽(yáng)

（1.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 普外科，貴州 貴陽(yáng)550002；2.第三軍醫(yī)大學(xué) 免疫教研室，重慶400030；3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 普外科，遼寧 大連116001）

腫瘤組織內(nèi)及其周圍浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞稱作腫瘤相 關(guān) 巨 噬 細(xì) 胞 （tumor－associated macrophages，TAMs），以往認(rèn)為在腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞越多，腫瘤進(jìn)展越慢，預(yù)后越好。近年來(lái)的研究表明，多種腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤病人預(yù)后不良的指標(biāo)［1］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）參與腫瘤發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，并在促進(jìn)血管和淋巴管生成過(guò)程中起重要作用［2］。目前關(guān)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在不同分期的胃癌中浸潤(rùn)以及對(duì)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)率的影響的研究尚少，本研究采用免疫組化方法對(duì)52例胃癌組織進(jìn)行CD68染色以檢測(cè)、比較腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在不同分期的胃癌組織的浸潤(rùn)，并通過(guò)術(shù)后隨訪比較腫瘤三年內(nèi)的腫瘤復(fù)發(fā)率，進(jìn)一步了解腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌組織標(biāo)本取材于重慶腫瘤醫(yī)院2009年－2010年52例胃癌手術(shù)病人，年齡28歲－76歲，男性36例，女性16例。術(shù)前均未行放化療以及其他抗腫瘤治療。所有病人均行D2胃癌根治術(shù)，術(shù)后記錄病理類型、臨床分期、分化類型。所有病人術(shù)后均行XELOX方案化療6個(gè)周期。術(shù)后通過(guò)住院、門(mén)診復(fù)診以及電話聯(lián)系方式對(duì)病人隨訪3年。

1.1.2 CD68抗體免疫組化試劑盒購(gòu)自abcam公司。

1.2 方法

取術(shù)后胃癌組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟至水，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，3%過(guò)氧化氫避光孵育10min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗，微波抗原修復(fù)10min，滴加血清工作液，室溫孵育15min封閉非特異性抗原；滴加一抗后置入冰盒4℃過(guò)夜。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。PBS洗3次，滴加二抗，室溫 孵育30min，PBS洗滌，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，PBS洗滌，DAB顯色，蒸餾水終止，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水、二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

1.3 結(jié)果判定

CD68在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，胞漿含清晰的黃褐色或黃色顆粒狀者為陽(yáng)性。觀察胃癌組織切片中TAM最密集的區(qū)域，選擇5個(gè)區(qū)域在400倍視野下計(jì)數(shù)并取其平均值即為該組織切片中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量［3，4］。取本組所有胃癌病人的TAM浸潤(rùn)的中位數(shù)作為區(qū)分高密度和低密度的分界點(diǎn)［5］，將52例胃癌病人分為高密度組和低密度組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD68在胃癌組織中的表達(dá)情況

本組52例胃癌組織標(biāo)本均見(jiàn)不同程度的CD68陽(yáng)性表達(dá)，主要集中在胃癌間質(zhì)內(nèi)，即TAM主要在胃癌組織的間質(zhì)中浸潤(rùn)。52例標(biāo)本TAM浸潤(rùn)的范圍為70.28±29.34/HP，浸潤(rùn)的密度為23－154/HP，平均70.3/HP，中位數(shù)63/HP。如圖1所示。

圖1 TAM在胃癌組織中的浸潤(rùn)（CD68，×400）

2.2 不同 分期胃癌組織中 浸潤(rùn)的比較

如表1所示，本組病例中TAM在Ⅰ－Ⅱ期共17例，TAM 浸潤(rùn)的密度為41.02±8.47/HP；Ⅲ期28例，TAM 浸潤(rùn)的密度為74.10±13.49/HP；Ⅳ期7例，TAM 浸潤(rùn)的密度為126.10±13.35/HP。三者比較有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 TAM在胃癌組織有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中浸潤(rùn)的比較

本組病例有13例標(biāo)本無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TAM浸潤(rùn)的密度為38.36±7.87/HP；而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，TAM 浸潤(rùn)的密度為81.78±25.68/HP，兩者比較有明顯差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 TAM在52例胃癌組織中浸潤(rùn)情況

2.4 胃癌組織高密度TAM浸潤(rùn)與低密度浸潤(rùn)對(duì)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)率的影響

本組52例胃癌病人中，術(shù)后一年的總復(fù)發(fā)率為21.15%，術(shù)后二年累計(jì)復(fù)發(fā)率為42.31%，術(shù)后三年累計(jì)復(fù)發(fā)率為57.69%。以52例標(biāo)本TAM浸潤(rùn)密度的中位數(shù)63/HP為分界點(diǎn)，分為高密度組27例，低密度組25例，高密度組在術(shù)后1年、2年、3年的累計(jì)復(fù)發(fā)率明顯高于低密度組（P＜0.05）。如表2所示。

表2 胃癌組織中不同密度浸潤(rùn)的TAM對(duì)術(shù)后累計(jì)復(fù)發(fā)率的影響

3 討論

腫瘤組織中浸潤(rùn)的炎細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主，腫瘤組織中浸潤(rùn)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞曾被認(rèn)為是機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)的表現(xiàn)。近年的研究認(rèn)為腫瘤組織中浸潤(rùn)的炎細(xì)胞可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，高密度浸潤(rùn)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與病人的不良預(yù)后相關(guān)［1］。宋宇峰等的研究［6］發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞較正常組織中明顯增多。但目前對(duì)惡性腫瘤組織內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞增多的機(jī)制尚不明了。

本次研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在不同TNM分期的胃癌組織中浸潤(rùn)的密度上有明顯差異，腫瘤分期越晚其內(nèi)浸潤(rùn)的TAM密度越高。進(jìn)一步提示胃癌組織中浸潤(rùn)的TAM密度越高預(yù)示著胃癌的惡性程度越高，病人的腫瘤分期越晚，TAM參與了促進(jìn)胃癌進(jìn)展，TAM與胃癌病人不良預(yù)后相關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的TAM密度明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，也說(shuō)明了高密度的TAM在胃癌組織中浸潤(rùn)能促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。在對(duì)胃癌組織中浸潤(rùn)的高密度TAM與低密度TAM對(duì)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)率的研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌病人高密度組在術(shù)后一年、二年、三年的累計(jì)腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于低密度組。胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率越高意味著病人術(shù)后生存率越短。這進(jìn)一步說(shuō)明胃癌組織中高密度浸潤(rùn)的TAM能促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)，高密度浸潤(rùn)的TAM是胃癌病人預(yù)后不良的重要因素。

現(xiàn)有的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來(lái)源于外周血循環(huán)中的單核細(xì)胞，是在多種趨化因子的作用下遷移到腫瘤間質(zhì)中然后分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有遞呈腫瘤抗原和吞噬腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞毒性效應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞可通過(guò)其復(fù)雜的自分泌、旁分泌途徑，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的惡性增殖及凋亡密切相關(guān)［7］。Melichar［8］發(fā)現(xiàn)上皮性惡性卵巢癌病人的腹水中巨噬細(xì)胞與外周血中的巨噬細(xì)胞在表型與功能上不一致。馮紅超等的研究［9］提示在缺氧的環(huán)境下單核/巨噬細(xì)胞分泌的V EGF的能力增加，推測(cè)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的血管生成而更多地參與了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本次研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織分期越晚其內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞越多，提示在胃癌分期晚者其內(nèi)增多的巨噬細(xì)胞主要是M2型巨噬細(xì)胞，而這種對(duì)胃癌細(xì)胞喪失殺傷、吞噬功能的免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)了胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致胃癌病人術(shù)后的復(fù)發(fā)率增高。

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)是病人最常見(jiàn)的致死原因。外科手術(shù)以及術(shù)后化療并不能明顯的有效降低病人的術(shù)后復(fù)發(fā)率和延長(zhǎng)生存率。因此，揭示胃癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制以及巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制，如何調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞表型向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及抑制M2型巨噬細(xì)胞的功能，不但對(duì)延長(zhǎng)胃癌病人的生存率和減少?gòu)?fù)發(fā)率有重要意義，也將為胃癌病人的免疫治療提供一個(gè)新的途徑。

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