任林廣，趙珍誼，張 健，徐廣偉，段北野

（1.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長(zhǎng)春130012；2.長(zhǎng)春百克生物科技股份公司，吉林 長(zhǎng)春130012）

腫瘤微環(huán)境 （tumor microenvironment）是腫瘤所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及所分泌的活性介質(zhì)、微血管、組織液等與腫瘤細(xì)胞本身共同構(gòu)成［1，2］。不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，也與腫瘤細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境有關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發(fā)展的條件，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。近年來(lái)由于腫瘤細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們對(duì)于腫瘤和環(huán)境的相互關(guān)系有深入了解，認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有著重要的意義。本研究通過(guò)觀察熱休克處理的SMMC－7721細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)臍血淋巴細(xì)胞表型及殺傷活性的影響，進(jìn)一步探討腫瘤微環(huán)境中某些成分的改變與腫瘤局部浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞之間的關(guān)系及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人臍帶血采自長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院，K562人紅白血病細(xì)胞株和SMMC－7721人肝癌細(xì)胞株均由本所細(xì)胞室提供，人重組干擾素－γ（rIFN－γ）購(gòu)自長(zhǎng)春寶泰克生物科技公司，CFSE（C－1157）購(gòu)自Molecular Probes公司，PI購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱休克處理的SMMC－7721細(xì)胞上清制備收集處于指數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC－7721細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L，接種于培養(yǎng)皿中，6×106個(gè)細(xì)胞/皿，常規(guī)培養(yǎng)48h，更換無(wú)血清IMDM，然后將一組培養(yǎng)皿于37℃條件下培養(yǎng)，另一組于42.5℃條件下培養(yǎng)。24h后分別收獲上清，離心（10 000 rpm，10min），分裝，80℃保存?zhèn)溆?。用分光光度?jì)測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 臍血單個(gè)核細(xì)胞制備 將采集的臍血用生理鹽水稀釋?zhuān)B加到淋巴細(xì)胞分離液液面上，離心（2 000rpm，20min），吸取界面層細(xì)胞，生理鹽水洗滌2次。用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3.5×106個(gè)/mL。

1.2.3 腫瘤培養(yǎng)上清及細(xì)胞因子誘導(dǎo) 將上述制備的臍血單個(gè)核細(xì)胞接種于6孔板中，3ml/孔，分6組。①I(mǎi)MDM（對(duì)照組）；②37℃培養(yǎng)上清 （SN1）；③42.5℃培養(yǎng)上清 （SN2）；④IFN－γ，；⑤SN1＋I(xiàn)FN－γ；⑥SN2＋I(xiàn)FN－γ，每組4復(fù)孔。SN1和SN2的終濃度為50μg/ml，IFN－γ終濃度為1 000μg/ml，對(duì)照組以等體積IMDM 代之。將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)一周。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化并照相。

1.2.5 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)四色熒光標(biāo)記，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，采用CellQuestPro軟件分析T淋巴細(xì)胞群體百分含量。實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下：加入熒光抗體CD45//483染液5μl于A管中，CD3/16＋56染液10μl于B管中，向各管內(nèi)分別加入相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞樣品，各100μl，充分混勻，20－25℃條件下避光標(biāo)記15－20min。再向各管內(nèi)分別加入生理鹽水1ml，震蕩混勻，避光保存。4h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 NK活性檢測(cè) 采用CFSE/PI雙熒光染料標(biāo)記的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法［3］。方法簡(jiǎn)述如下：

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml.加入 CFSE（使終濃度為2.5μmol/L），置37℃孵箱內(nèi)標(biāo)記8min。生理鹽水洗滌3次，重懸于10ml含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度為6×104個(gè)/ml。將此CFSE標(biāo)記的K562作為靶細(xì)胞加入U(xiǎn)型底96孔板中，100μl/孔。收獲前述不同條件誘導(dǎo)的臍血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/ml作為效應(yīng)細(xì)胞，加入U(xiǎn)型底96孔板中，100μl/孔，效靶比50∶1。37℃培養(yǎng)4h。收取各組細(xì)胞于相應(yīng)標(biāo)號(hào)的試管中。取未標(biāo)記的K562細(xì)胞、CFSE標(biāo)記的K562細(xì)胞和對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞各少許作為調(diào)試電壓的對(duì)照。向所有各管中分別加入PI（100μg/ml）25μl。再向各管中補(bǔ)加生理鹽水1 ml，混勻，冰水浴5min，流式細(xì)胞儀測(cè)樣。收集1000個(gè)靶細(xì)胞，測(cè)量PI和CFSE雙標(biāo)記細(xì)胞的百分比。殺傷活性的計(jì)算公式為：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一周后，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，形態(tài)有明顯不同。在IMDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，可見(jiàn)少許細(xì)胞碎片；在含SN1的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，數(shù)量減少，碎片增多；當(dāng)細(xì)胞在含SN2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)狀態(tài)較好并且可見(jiàn)到很多小細(xì)胞。但是當(dāng)在培養(yǎng)體系中單獨(dú)加入IFN－γ后，細(xì)胞變大變圓，數(shù)量增加。而在IFN－γ培養(yǎng)體系中加入SN1后大圓細(xì)胞數(shù)量減少但加入SN2時(shí)大圓細(xì)胞數(shù)量又有所增加（圖略）。

2.2 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞表型及殺傷活性的變化

2.2.1 臍血淋巴細(xì)胞表型的變化 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)一周后細(xì)胞表型發(fā)生改變。表現(xiàn)在：SN1組 CD3＋、CD4＋、CD3－CD16＋CD56＋和CD3＋CD16＋CD56＋四個(gè)亞群的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組（IMDM）比較沒(méi)有明顯差別，CD8＋ 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降（P＜0.05）；SN2組表中五個(gè)亞群的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較均沒(méi)有明顯差別，但是CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與SN1組比較明顯增加（P＜0.05）；IFNγ組CD3＋、CD4＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；而CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯增加（P＜0.01）；IFNγ＋SN1組表中前4個(gè)亞群細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與IFNγ組比較均明顯降低（P＜0.05），與對(duì)照組比較CD3＋、CD4＋ 、CD8＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也明顯降低（P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)雖然高于對(duì)照但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IFNγ＋SN2組與對(duì)照組比較CD3＋、CD4＋和CD8＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞比例明顯增高（P＜0.01），而與IFNγ組比較則只有CD4＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0.05）。與IFNγ＋SN1組比較各亞群均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是，CD8＋ 和CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞比例有所增高。見(jiàn)表1。

表1 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞表型的變化

2.2.2 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞殺傷活性的變化 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)一周后，細(xì)胞殺傷活性發(fā)生明顯改變且與細(xì)胞表型改變一致。SN1組NK活性與對(duì)照組（IMDM）比較明顯降低（P＜0.05）；SN2組較SN1組活性增強(qiáng)，差異顯著（（P＜0.05）；IFNγ組細(xì)胞殺傷活性比較對(duì)照組非常顯著提高（P＜0.01）；IFNγ＋ SN1組較IFNγ組明顯降低（P＜0.01）與對(duì)照組及SN1組相比無(wú)明顯差異；IFNγ＋SN2組殺傷活性低于IFNγ組（P＜0.01），高于IFNγ＋ SN1組（P＜0.05），但與對(duì)照組和SN2組比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

表2 臍血淋巴細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞殺傷活性的變化

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)能夠啟動(dòng)熱應(yīng)激基因的表達(dá)，產(chǎn)生一組高度保守的熱應(yīng)激蛋白（heat shock proteins，HSPs），其中最主要的是HSP70。HSP70按表達(dá)情況又可分為結(jié)構(gòu)型HSP70和誘導(dǎo)型HSP70，前者在應(yīng)激情況下略增加。而后者僅出現(xiàn)于應(yīng)激細(xì)胞，通常在正常細(xì)胞中并不表達(dá)或表達(dá)量很少。但是在應(yīng)激原的作用下則表達(dá)迅速增加，并可釋放到周?chē)h(huán)境中。大量的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)充分證明了熱應(yīng)激處理能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)和釋放 HSP70［4－7］，并且證實(shí)了細(xì)胞外HSP70能夠激活T輔助細(xì)胞，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性［8］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，42.5℃熱休克處理的SMMC－7721細(xì)胞培養(yǎng)上清（SN2）可以使臍血淋巴細(xì)胞亞群比例發(fā)生改變，表現(xiàn)在CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與37℃常規(guī)條件下的SMMC－7721培養(yǎng)上清（SN1）組比較明顯增加（P＜0.05），同時(shí)，細(xì)胞殺傷活性也有改變，SN1組臍血淋巴細(xì)胞的殺傷活性較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05），而SN2組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差別（P＞0.05）但較SN1組明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了熱應(yīng)激處理后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清較常規(guī)條件下的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)臍血淋巴細(xì)胞的抑制作用大大減輕，這可能與熱應(yīng)激處理后的腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放HSP70有關(guān)。

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