陳佳玉，戚永孝，陳 潔，金曉燕，張麗榮

（1.臺州學院醫(yī)學院，浙江 臺州318000；2.臺州市立醫(yī)院，浙江 臺州318000；3.長春市中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春130033）

丙肝病毒感染嚴重威脅人類健康，疫苗可能是治療該感染的有效方法之一。目前，丙肝治療性疫苗的研究多是在丙肝結(jié)構(gòu)蛋白基礎(chǔ)上進行改造，融合適當?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)因子是提高蛋白免疫原性的有效方法之一。CD40L胞外段能與樹突狀細胞表面CD40分子結(jié)合，促進樹突狀細胞成熟，促進特異性免疫反應(yīng)，與HCV core融合后有望提高其免疫原性。本實驗在原有質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了帶有HCV core和CD40L胞外段融合蛋白的真核表達載體pcDNA3.1－core－CD40L，并探討了其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

帶有丙肝核心抗原的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1－HCV core及帶有人CD40L胞外段基因序列（GeneralBank編號NM＿000074）的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1CD40L均為本室保存。內(nèi)切酶和連接酶均購自于TaKaRa，CD4和CD8熒光標記抗體為BD公司的產(chǎn)品。5周齡雄性ICR小鼠來源于浙江省實驗動物中心。丙肝病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自于健侖。所得實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異性進行t檢驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

利用基因重組技術(shù)在原有質(zhì)粒pcDNA3.1－HCV core和pcDNA3.1－CD40L的基礎(chǔ)上構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1－core－CD40L，并經(jīng)酶切鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1。

圖1 質(zhì)粒pcDNA3.1－core－CD40L構(gòu)建流程圖

1.2.2 免疫原性檢測

超純質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，100μg/只大腿肌肉內(nèi)注射免疫5周齡雄性ICR小鼠，每周免疫一次，共兩次，二次免疫后七天殺鼠取外周血和脾，分離血清及淋巴細胞（密度梯度離心）。ELISA檢測試劑盒檢測血清中抗丙肝核心抗體；取外周血單個核細胞，熒光標記的抗CD4、CD8抗體染色后，利用流式細胞儀檢測T細胞亞型；取所得脾淋巴細胞，利用T細胞富集柱分離T細胞，經(jīng)PE標記的CD3抗體進行標記后，通過流式細胞儀檢測T細胞純度；并用佛波醇酯（Phorbol－12－myristate13－acetate，PMA）和離子霉素（Ionomycin，Ion）刺激 T細胞，6小時后用Real time PCR法檢測T細胞內(nèi)IL－2 mRNA、IFN－γmRNA 及 IL－4mRNA 的 水 平。PCR引物序列如表1。同時以本實驗室制備的HCV體外感染細胞模型為靶細胞，以上述脾淋巴細胞為效應(yīng)細胞，效靶比5∶1來進行細胞殺傷實驗，并通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

表1 細胞因子PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 HCV核心抗體效價的檢測

免疫后小鼠外周血經(jīng)ELISA檢測試劑盒檢測，結(jié)果顯示，質(zhì)粒pcDNA3.1－core－CD40L免疫小鼠，可誘使小鼠產(chǎn)生高滴度的抗丙肝核心抗原抗體（4266±328），P＜0.01。

2.2 外周血淋巴細胞亞型的檢測

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：質(zhì)粒pcDNA3.1－core－CD40L免疫組小鼠外周血中CD4＋和CD8＋細胞比例明顯增加，且以CD8＋細胞增高更為顯著，P＜0.01。如表2。

表2 小鼠外周血T淋巴細胞亞型流式細胞儀檢測結(jié)果

2.3 T細胞內(nèi)細胞因子檢測

Real time PCR檢測結(jié)果顯示：pcDNA3.1－core－CD40L免疫組小鼠T細胞內(nèi)細胞Th1型和Th2型細胞因子分泌均明顯高于對于照組，P＜0.01。同時Th1型細胞因子分泌水平的增高明顯高于 Th2 型。檢 測結(jié)果提示，pcDNA3.1－core－CD40L免疫組更易誘發(fā)T0細胞向Th1型細胞轉(zhuǎn)換。如表3。

表3 T細胞內(nèi)細胞因子Real time PCR檢測結(jié)果

2.4 CTL殺傷活性檢測

以感染有HCV的Hela細胞為靶細胞，按效靶比5∶1加入效應(yīng)細胞，37℃5%CO2條件下孵育18－24h。經(jīng)清洗后，流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示：pcDNA3.1－core－CD40L組細胞凋亡比例（54.1%）明顯高于對照組（30.9%），即誘發(fā)了較強的CTL殺傷活性，P＜0.01。

圖2 CTL殺傷活性檢測結(jié)果

3 討論

HCV感染目前在世界范圍內(nèi)流行廣泛且已嚴重影響著人類的健康，雖然眾多科學工作者對HCV感染的防治作了多次嘗試，但目前尚無很好的辦法將其徹底治愈［1，2］。為了制備有效的丙肝治療性疫苗，本實驗選取基因比較穩(wěn)定的HCV核心區(qū)基因［3］，并將此基因與CD40基因的胞外段進行重組，構(gòu)建成真核表達載體。CD40L是一個Ⅱ型跨膜糖蛋白，為TNF超家族成員之一，它是參與機體特異性細胞免疫和體液免疫的重要免疫共刺激分子，能與表達于樹突細胞表面的CD40分子作用，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。經(jīng)CD40L刺激后的DC具有如下特性：①抗原遞呈能力增強；②具有較強的T淋巴細胞趨化能力；③體外刺激T淋巴細胞增殖反應(yīng)能力增強；④表面CD80、CD86等共刺激分子明顯上調(diào)，并能夠產(chǎn)生大量的IFN－γ、IL－12、TNF－α等細胞因子，促進T細胞由Th0向Th1轉(zhuǎn)化［4］。因此，本實驗小組以基因重組的方式構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1－core－CD40L，并對其免疫原性進行了檢測。結(jié)果揭示，該疫苗肌肉內(nèi)注射免疫小鼠，能誘發(fā)其產(chǎn)生抗HCV核心抗原的高水平抗體。T細胞亞型流式細胞儀檢測結(jié)果及T細胞內(nèi)細胞因子Realtime PCR檢測結(jié)果證實該疫苗能誘使T0細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)換。特異性CTL殺傷實驗結(jié)果提示該疫苗能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生強的細胞免疫反應(yīng)，可能對HCV感染一定的防治作用。

［1］Cohen J.The scientific challenge of hepatitis C［J］.Science，1999，285：26.

［2］Popescu C，Gliga S and Arama V.Trends in hepatitis C virus infection therapy：protease inhibitors a step forward in the era of direct acting antivirals［J］.Rom J Intern Med，2013，50（2）：117.

［3］Dawson GJ.The potential role of HCV core antigen testing in diagnosing HCV infection［J］.Antivir Ther，2012，17（7Pt B）：1431.

［4］林賢凡，吳金明，陳 瑾，等.乙肝表面抗原－CD40L胞外段融合蛋白的設(shè)計和生物活性預測［J］.溫州醫(yī)學院學報，2009，3：205.