石建玲，程 波，劉 珊，吳西釗，權(quán)蘭菊，丁姍姍，孫鎖柱

（中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京100088）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）自1983年被澳大利亞學(xué)者沃倫（Warren）與馬歇爾（Marshal1）［1］發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外對(duì)它的分子生物學(xué)、致病機(jī)制、流行病學(xué)、相關(guān)疾病等方面進(jìn)行了大量的研究［2－5］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也已經(jīng)證明，HP可以導(dǎo)致慢性胃炎、十二指腸腸炎、消化性潰瘍、胃癌、粘膜相關(guān)性淋巴瘤（MALT）等疾病的發(fā)生。WHO將HP作為胃癌的主要致病因子。因此，快速、準(zhǔn)確的檢測HP的感染對(duì)大眾健康具有重要意義，對(duì)醫(yī)生治病也有巨大幫助。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，目前，國內(nèi)已應(yīng)用該技術(shù)檢測了百日咳鮑特菌［6］和沙眼衣原體［7］等多種微生物的感染。我們以HP高度保守的23SrDNA基因片段序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來檢測HP。

1 材料與方法

1.1 樣品

選取市售的HP菌株26695，對(duì)照菌株有Brevibacterium casei，Klebsiella pneumonia，Staphylococcus capitis，Microbulbifer elongates，Microbacterium sp，Streptococcus cristatus，Pichia anomala，EHEC，EIEC，Salmonella typhi，Dysentery bacterium，Vibrio Cholerae。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTPs、pEASY－T載體、DNA提取的試劑盒（Omega E.Z.N.A.MicroElute Genomic DNA Kit）、大腸桿菌DH5a、幽門螺桿菌抗體、DAB顯色液、W－S銀染試劑、SMA4000核酸蛋白分析儀、ABI7500P實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀等。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)

選取高度保守的HP特異性的23SrDNA基因序列，利用Primer Express 3.0軟件進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。引物和探針序列如下：

P1：gattcagtgaaattgtagtggagg

P2：tcccattagcagtgctaagttg

探針：5′－gcggcaagacggaaagaccccgtgg－3′

引物及探針由英俊公司合成，擴(kuò)增目的片段長度為99bp，其他實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系組分（ExTaq酶等）購自takar公司。

1.4 模板DNA的制備

按照購買的DNA提取試劑盒標(biāo)明的方法進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.5 制備質(zhì)粒

反應(yīng)體系為20μl，以P1、P2為引物，反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃10s，60℃45s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增得到的目的片段克隆至pEASY－T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證后作為熒光定量PCR的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋成1.0×107～1.0×101拷貝每微升作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在不同退火溫度下進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，確定最佳退火溫度。20μl體系Taqman熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 45s，40個(gè)循環(huán)；應(yīng)用矩陣法對(duì)熒光定量PCR的引物、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳反應(yīng)條件。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以每微升拷貝數(shù)為107、106、105、104、103、102、101的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，最佳反應(yīng)條件下在ABI－7500熒光定量PCR儀上檢測，得出各自的動(dòng)力學(xué)曲線，儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 敏感性試驗(yàn)

取不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。根據(jù)樣品拷貝數(shù)與CT值之間的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)確定最小檢測量。

1.9 特異性試驗(yàn)

對(duì)選取的對(duì)照菌株進(jìn)行DNA提取，按照建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行測定，建立特異性試驗(yàn)。

1.10 可重復(fù)性試驗(yàn)

將105、104、103、102不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)變異系數(shù)確定檢測體系的可重復(fù)性。

1.11 臨床胃鏡標(biāo)本檢測

對(duì)2012年5月至10月收集的100份胃鏡樣本進(jìn)行檢測同時(shí)用免疫組化方法和銀染進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

每微升拷貝數(shù)為107、106、105、104、103、102、101的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線（圖1），同時(shí)儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性關(guān)系為Y＝－3.605X＋42.853。標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線顯示107－102有明顯的S型擴(kuò)增曲線，而且指數(shù)增長期的曲線平行，說明PCR的擴(kuò)增效率相近；不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品之間的Ct值相差均勻，這與定量PCR的Ct值與起始拷貝數(shù)之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系相一致。

圖1 幽門螺桿菌Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖2 幽門螺桿菌Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，R2值為1。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線在107至102拷貝每微升范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系。

2.2 檢測方法的敏感性

將以上拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，該方法至少可以檢測出每微升102拷貝數(shù)的HP樣品。

2.3 檢測方法的特異性

用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)HP和對(duì)照菌株進(jìn)行檢測，只有HP為陽性，其余均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性分析不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)重復(fù)測定3次，其變異系數(shù)在1%－2%范圍之間，均在可接受的范圍內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法檢測幽門螺桿菌具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 臨床胃鏡標(biāo)本檢測

實(shí)時(shí)熒光定量PCR以Ct值≤35并且擴(kuò)增曲線呈 “S”形為陽性的判定原則。對(duì)100份樣本進(jìn)行檢測，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢出31份陽性，而免疫組化方法能檢出25份陽性，銀染方法能檢出28份陽性（圖3、圖4）。

圖3 免疫組化法染色陽性結(jié)果（10×40）

圖4 銀染法染色陽性結(jié)果（10×40）

3 討論

眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種直接檢測核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，該方法靈敏度高、特異性好、操作簡單，它已廣泛應(yīng)用于多種微生物感染的檢測［6，7］，國 內(nèi) 外 亦 有 用 該 方 法 檢 測 HP 的 報(bào)道［8，9］。江南［10］和李廣云［11］的熒 光定量 PCR 檢測選用的是HP的16SRNA基因，而我們選用的是HP的23SrDNA基因，DNA比RNA穩(wěn)定，不易降解，提取DNA比提取RNA的技術(shù)要求要低，操作簡單；同時(shí)江南采用的是SYBR GreenⅠ，而我們采用的是Taqman探針的方法，Taqman探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在5′末端，淬滅基團(tuán)連接在3′末端，一分子的產(chǎn)物生成伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生，因此Taqman探針檢測的是積累熒光，由于增加了探針的識(shí)別步驟，它的特異性更高。而SYBR GreenⅠ屬于非探針類，是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料，由于它不能識(shí)別特定的雙鏈，因此它的特異性較差，對(duì)PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，所以會(huì)有假陽性的發(fā)生。

用該方法與免疫組化、銀染共同檢測100例臨床胃鏡標(biāo)本，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有較高的敏感性，可以大大降低漏檢率。免疫組織化學(xué)和銀染是將所取的胃黏膜標(biāo)本切片染色鏡檢，通過實(shí)踐發(fā)現(xiàn)。免疫組織化學(xué)和銀染容易發(fā)生染液的雜質(zhì)干擾，產(chǎn)生假陽性，它的敏感性和特異性都依賴于觀察者的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)。

本研究結(jié)果顯示，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有以下特點(diǎn)：（1）檢測范圍寬，在107－102copies/ul范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1；（2）靈敏度高，可檢測102copies/ul的樣本；（3）特異性高，與多種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。（4）檢測速度快，整個(gè)PCR反應(yīng)過程僅需70min。（5）重復(fù)性好，不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)重復(fù)測定3次，其變異系數(shù)在1%－2%范圍之間范圍。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法是近年來應(yīng)用較為廣泛的一種檢測方法，具有快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。本文從引物和探針的設(shè)計(jì)、PCR程序的設(shè)計(jì)等方面建立了HP檢測的一種方法，是對(duì)目前臨床HP檢測方法的一種補(bǔ)充與完善，具有重要的臨床意義。

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