陳 霖，姜 巖，汪鵬合，施國新，喬緒強(qiáng)，田秀麗

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210046)

隨著電鍍、電池和電子設(shè)備制造、油脂催化加工等工業(yè)的發(fā)展和大量化石燃料的燃燒，進(jìn)入水環(huán)境的Ni2+呈逐年上升之勢，并已成為水環(huán)境主要的金屬污染物之一［1］.據(jù)估計(jì)全球每年釋放到環(huán)境中的有毒重金屬高達(dá)數(shù)百萬噸，其中鎳為38.1×105t［2］.而我國，受重金屬污染的農(nóng)田面積在不斷增加、土壤污染程度有加重的趨勢，如廣東省海南市某電鍍廠廢水使得下游農(nóng)田土壤中鎳含量超過允許限值4.54倍、生菜和菜心分別超過允許限值的0.75倍和1.23倍［3］.鎳雖為植物的必需微量元素，但其含量若超過臨界值，則不利于植物的正常生長，甚至?xí)茐闹参锛?xì)胞核仁結(jié)構(gòu)，降低葉片葉綠素含量，影響活性氧水平及抗氧化系統(tǒng)等［4-7］.脯氨酸是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它還可以參與氧自由基清除，從而降低重金屬誘發(fā)的氧化脅迫對植物的傷害［8-9］.大量資料表明，在干旱、高鹽、極端溫度、冰凍、紫外線脅迫等條件下，植物體會通過脯氨酸合成的增加和降解的減少提高體內(nèi)脯氨酸的含量以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)［10-12］.目前，關(guān)于脯氨酸代謝途徑的研究主要集中于鹽脅迫［13-15］，而對于水生植物抵抗重金屬脅迫方面卻很少涉及.

目前關(guān)于重金屬毒害機(jī)制的實(shí)驗(yàn)材料均來自于野外植物體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易受外界環(huán)境的限制.而本文以植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出的菹草無菌苗為實(shí)驗(yàn)材料，重復(fù)性強(qiáng)，數(shù)據(jù)更為可靠、準(zhǔn)確.本文通過研究不同濃度Ni2+脅迫對菹草H2O2、及 MDA、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)、抗氧化劑(AsA、GSH、NP-SH 和 PCs)的影響，以期為植物的抗性原理增加相關(guān)的理論依據(jù).并研究Ni2+脅迫下菹草脯氨酸含量及其代謝途徑關(guān)鍵酶的變化，試圖揭示Ni2+脅迫下脯氨酸積累的生化機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 供試材料

菹草(Potamogeton crispus L.)，眼子菜科(Potamogetonaceae)眼子菜屬(Potamogeton)，多年水生草本植物.于2010年11月采自南京市琵琶湖水域，以幼嫩菹草帶節(jié)間的莖段培養(yǎng)的無菌苗為研究對象.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菹草無菌苗的培養(yǎng) 取生長旺盛的菹草去除根和葉，用清水沖洗干凈.依次經(jīng)過5%的H2O215 min、10%的NaClO 30 s消毒，然后用無菌水清洗6遍后，將其剪成1 cm左右.辨認(rèn)形態(tài)學(xué)上端后，插入到添加6-BA(2.0 mg/L)和IBA(0.5 mg/L)MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化.待莖間側(cè)芽長至2 cm之時(shí)，轉(zhuǎn)入添加6-BA(1.0 mg/L)的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng).在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)月后，轉(zhuǎn)入滅菌的1/10 Hongland培養(yǎng)液中生根培養(yǎng).生長期均在培養(yǎng)室中完成，光照周期為16 h∶8 h(L∶D)，光照強(qiáng)度為240～300 μmol/(m2·s)，光暗溫度為 25℃∶18℃(L∶D).

1.2.2 菹草無菌苗 Ni2+處理 選取大小相似、生長狀況一致的菹草無菌苗置于含 0、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L NiCl2(以純Ni2+計(jì))的無菌1/10 Hongland培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)條件與培養(yǎng)菹草無菌苗時(shí)一致.處理5 d后進(jìn)行生理指標(biāo)測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 SOD、POD和CAT活性的測定 SOD活性測定采用NBT光化還原法［18］，以抑制NBT光還原50%所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(U);POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚方法［19］，以每分鐘OD470的變化為1個(gè)酶活性單位(U);CAT活性測定采用鉬酸鹽方法［20］，以每分鐘分解1 μmol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活性單位(U).

1.2.5 GSH、AsA、非蛋白巰基和植物絡(luò)合素含量測定 GSH和AsA含量測定用陳建勛等［21］的方法;非蛋白巰基(NP-SH)和植物絡(luò)合素(PCs)含量測定用Nouairi等的方法［22］.

1.2.6 脯氨酸含量及P5CS、OAT、ProDH活性的測定 脯氨酸含量用酸性茚三酮法［23］;吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性的測定參照趙貴林等的方法［24］，以ΔOD535h－1表示一個(gè)酶活單位(U);鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)和脯氨酸脫氫酶(ProDH)活性的測定參照 Yang 等［25］的方法，分別以 ΔOD510和0.1 ΔOD340min－1為一個(gè)酶活單位(U).

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為其平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.運(yùn)用Excel進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)與Ni2+濃度的相關(guān)性分析并完成制圖，用相關(guān)系數(shù)r對各指標(biāo)與Ni2+濃度間進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì);P＜0.05表示顯著相關(guān);P＜0.01表示極顯著相關(guān).由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對各數(shù)據(jù)均值進(jìn)行“單因素方差分析”完成數(shù)值間的差異性分析;P＜0.05，表示差異顯著;P＜0.01，表示差異極顯著，本文圖表中不同小寫字母表示數(shù)值之間差異顯著(P＜0.05)，相同字母之間差異不顯著.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Ni2+對菹草H2O2含量、產(chǎn)生速率和MDA含量的影響

當(dāng)Ni2+濃度為0～0.10 mmol/L時(shí)，菹草H2O2含量呈上升趨勢，并在0.10 mmol/L處理濃度時(shí)達(dá)到最大值，是對照組的1.75倍，隨著濃度進(jìn)一步升高，H2O2含量略微降低，但仍高于對照組(圖1A);和MDA的含量隨著處理濃度的增加均呈上升趨勢，并在0.20 mmol/L處理濃度時(shí)達(dá)到最大值，分別為對照組的1.45和1.43 倍(圖1B、C);統(tǒng)計(jì)分析表明，處理組中菹草 H2O2、和MDA含量與對照組相比，均表現(xiàn)為顯著差異(P ＜0.05);其中，的含量變化與Ni2+處理濃度間呈極顯著正相關(guān)(rO.2－=0.9840;P ＜0.01);MDA 含量變化與Ni2+處理濃度間呈顯著正相關(guān)(rMDA=0.8213;P＜0.05).

圖1 Ni2+脅迫對菹草H2O2、產(chǎn)生速率和MDA含量的影響Fig.1 Effects of Ni2+stress on H2O2content，generation rate and MDA content in P.crispus

2.2 Ni2+對菹草SOD、POD和CAT活性的影響

SOD、POD和CAT活性隨著Ni2+濃度的升高，均表現(xiàn)出先升后降的趨勢.在0.05 mmol/L Ni2+時(shí)，SOD活性最高為對照組的1.77倍，隨著處理濃度的逐漸升高，SOD的活性逐漸降低但均高于對照組(圖2A);處理組的POD活性與對照組相比，分別為對照組的1.23、1.30、1.31和1.19倍(圖2B);CAT的活性則在Ni2+濃度為0.05 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，為對照組的1.31倍，隨Ni2+濃度升高逐漸降低，且在0.20 mmol/L Ni2+處理時(shí)達(dá)到最低值，僅為對照組的70.39%(圖2C).統(tǒng)計(jì)分析表明，處理組中SOD和POD的活性變化與對照組相比，均達(dá)到顯著性差異水平(P＜0.05);CAT活性變化除0.15 mmol/L Ni2+處理組外，其他各處理組與對照組相比均達(dá)到顯著性差異(P＜0.05).

圖2 Ni2+脅迫對菹草SOD、POD和CAT活性的影響Fig.2 Effects of Ni2+stress on SOD，POD and CAT activities in P.crispus

2.3 Ni2+對菹草 AsA、GSH、NP-SH和 PCs含量的影響

AsA含量隨著Ni2+濃度的升高變化均不明顯;GSH和NP-SH的含量則隨著脅迫濃度的增加均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，并在 0.10 mmol/L Ni2+濃度下達(dá)到最大值，分別為對照組的 1.57倍和1.52倍;在0.05 mmol/L Ni2+脅迫下菹草PCs的含量變化不明顯，隨著Ni2+濃度的進(jìn)一步增加，PCs含量則表現(xiàn)為上升趨勢，在0.20 mmol/L Ni2+濃度下達(dá)到最大值，為對照組的1.54倍(表1).統(tǒng)計(jì)分析表明，處理組中AsA含量與對照組相比均無顯著性差異(P＞0.05);處理組 GSH含量與對照組相比，也只有 0.10和0.15 mmol/L Ni2+濃度下表現(xiàn)為顯著性差異(P＜0.05);而NP-SH和PCs含量，除0.05 mmol/L Ni2+濃度外其他各處理組均與對照組達(dá)到顯著性差異水平(P＜0.05);其中，PCs的含量變化與Ni2+處理濃度間呈極顯著正相關(guān)(rPCs=0.9654;P ＜0.01).

表1 Ni2+脅迫對菹草AsA、GSH、NP-SH和PCs含量的影響Tab.1 Effects of Ni2+stress on AsA，GSH，NP-SH and PCs contents in P.crispus

2.4 Ni2+對菹草脯氨酸含量及脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4.1 Pro含量的變化 在Ni2+脅迫下，Pro含量均高于對照組，并在0.15 mmol/L時(shí)其含量達(dá)到最大值，為對照組的1.61倍(圖3A).統(tǒng)計(jì)分析表明，處理組Pro的含量與對照組相比均達(dá)到顯著差異水平(P＜0.05).2.4.2 P5CS、OAT、ProDH活性的變化 低濃度 Ni2+處理時(shí)，菹草 P5CS活性變化不大，當(dāng) Ni2+濃度高于0.10 mmol/L時(shí)，P5CS的活性開始急速上升，并在0.20 mmol/L Ni2+處理時(shí)達(dá)到最大值，為對照組的1.39倍(圖3B);隨著處理濃度的升高，OAT的活性變化表現(xiàn)為先升后降的趨勢，在Ni2+濃度為0.10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值為對照組的1.29倍(圖3C);ProDH的活性隨著Ni2+濃度的升高無顯著變化(圖3D).統(tǒng)計(jì)分析表明，0.15和0.20 mmol/L Ni2+處理組的 P5CS活性與對照組相比較達(dá)到了顯著差異水平(P＜0.05);除0.15 mmol/L Ni2+處理組外，OAT的活性與對照組相比均表現(xiàn)為顯著性差異水平(P＜0.05);ProDH活性均與對照無顯著性差異(P＞0.05);其中，P5CS活性的變化與Ni2+處理濃度間達(dá)到顯著正相關(guān)(rP5CS=0.8913;P ＜0.05).

3 討論

重金屬脅迫對植物的重要毒害機(jī)制之一是導(dǎo)致過量活性氧的產(chǎn)生，從而影響其正常代謝［26］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重金屬Ni2+導(dǎo)致了菹草體內(nèi)和H2O2的大量積累.在高濃度Ni2+脅迫下，H2O2含量略有下降，這是由于:1)菹草體內(nèi)POD和CAT的分解作用，本文中CAT活性在高濃度(大于0.10 mmol/L)Ni2+下被明顯抑制，因此POD在此過程起主要作用;2)高濃度Ni2+脅迫下SOD活性下降，H2O2生成量降低;3)產(chǎn)生的H2O2與反應(yīng)生成了羥自由基(·OH)，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞膜的膜脂過氧化.MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量是反映膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜受破壞程度的重要指標(biāo)［27］.本文中，MDA的含量隨著濃度的增加不斷增加，充分表明Ni2+破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了氧化損傷.

植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT是活性氧酶促清除系統(tǒng)的關(guān)鍵酶.SOD能夠?qū)⑵缁蒆2O2，抑制Haber-Weiss反應(yīng)，CAT和POD可將H2O2分解成H2O，從而阻止和H2O2的積累［28］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SOD活性先升后降，但仍高于對照組.在正常的生理?xiàng)l件下，的積累可誘導(dǎo)SOD活性上升，但隨著脅迫加重，其活性反而受其衍生物H2O2和·OH的抑制［29-30］.在Ni2+脅迫下，POD相比CAT表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，其活性處理組始終高于對照組.高濃度Ni2+脅迫下CAT活性受到抑制可能是由于的過量積累導(dǎo)致［30］.然而，兩者共同作用并未有效清除H2O2，其含量始終高于對照組.另外，呈不斷上升趨勢，充分表明抗氧化酶不能有效阻止由Ni2+毒害導(dǎo)致的植物體內(nèi)過量活性氧的產(chǎn)生.

同時(shí)，植物體內(nèi)還存在 NP-SH、PCs、GSH和AsA等活性氧非酶促清除系統(tǒng)［31］.Mishra等研究認(rèn)為，NP-SH在抵抗重金屬脅迫中起到了非常重要的作用，它一方面可以作為PCs合成的前體，另一方面可直接作為抗氧化劑抵抗重金屬導(dǎo)致的氧化脅迫［32］.本文結(jié)果可以看出，NP-SH含量比對照組均有所升高，這與Mishra等［32］在對Cd脅迫下假馬齒莧的研究結(jié)果一致.GSH一方面可以直接同ROS反應(yīng)，將其還原，另一方面其自身的巰基可被氧化形成GSSG，防止由氧化逆境誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性［33-35］.Xiang等［36］認(rèn)為H2O2的過量積累可誘導(dǎo)編碼GSH合成酶的mRNA解除抑制，以增加GSH的含量.本實(shí)驗(yàn)中，GSH含量除0.05 mmol/L Ni2+處理組外均顯著高于對照組，且與H2O2變化趨勢保持一致.高濃度下其含量下降的原因可能是GSH作為PCs的前體參與了PCs的合成過程.PCs是植物體內(nèi)由重金屬誘導(dǎo)的能絡(luò)合重金屬的富含Cys的多肽［37］，其巰基與重金屬離子絡(luò)合形成無毒的化合物，減少細(xì)胞內(nèi)游離的重金屬離子的濃度，從而減輕重金屬的毒害作用［31］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCs含量與Ni2+濃度呈極顯著正相關(guān)，表明Ni2+脅迫可誘導(dǎo)PCs在菹草體內(nèi)大量積累.AsA不僅可在Halliw-Asada循環(huán)中作為APX的底物清除H2O2［38］，同時(shí)還可還原，清除·OH，猝滅O2，歧化H2O2，再生為α-生育酚［39］.本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比各處理組AsA含量均沒有顯著增加，表明Ni2+脅迫下AsA在清除氧自由基中未發(fā)揮作用.

圖3 Ni2+脅迫對菹草脯氨酸含量及P5CS、OAT和ProDH活性的影響Fig.3 Effects of Ni2+stress on proline content，P5CS，OAT and ProDH activities in P.crispus

脯氨酸除了作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以外，具有保護(hù)蛋白質(zhì)、生物膜、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和清除活性氧等功能，在保護(hù)植物細(xì)胞免受重金屬脅迫傷害中起到非常重要的作用［40］.文錦芬等研究發(fā)現(xiàn)Pro預(yù)處理可抑制Cd2+脅迫誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞H2O2的產(chǎn)生［41］;Ozden等［42］的研究表明，Pro預(yù)處理的葡萄葉片，能降低其在H2O2脅迫下的H2O2和MDA含量.本研究結(jié)果顯示，在Ni2+脅迫下，脯氨酸含量均有所上升，由此證實(shí)了Pro的積累是植物在逆境下細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能遭受傷害時(shí)機(jī)體做出的防護(hù)效應(yīng).植物細(xì)胞中脯氨酸合成有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑，谷氨酸途徑的關(guān)鍵酶為吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)為鳥氨酸途徑的關(guān)鍵酶［43］.Zhen等在對蘆葦?shù)难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，谷氨酸途徑是脯氨酸合成的主要途徑［44］;但Chen等［45］研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫下水稻葉片的脯氨酸合成途徑則以鳥氨酸途徑為主.因此，脯氨酸積累途徑因植物的種類、生理狀態(tài)及環(huán)境脅迫因子的不同而有所差異.在本研究中，低濃度(0.05～0.10 mmol/L)Ni2+脅迫下，OAT活性明顯上升，說明在低濃度Ni2+脅迫下，Pro的合成途徑主要是鳥氨酸合成途徑.然而，當(dāng)Ni2+濃度達(dá)到0.15 mmol/L時(shí)，OAT活性下降，P5CS活性則被明顯激活，表明高濃度Ni2+脅迫下菹草主要依靠谷氨酸途徑來增加脯氨酸的積累.同時(shí)，脯氨酸的積累還依賴于ProDH催化的脯氨酸降解［10］.在本實(shí)驗(yàn)中，菹草ProDH在Ni2+脅迫下變化不明顯，說明脯氨酸的降解對Ni2+脅迫下脯氨酸積累的作用不大，這與Chen等［45］的研究結(jié)果一致.

綜上所述，重金屬Ni2+可誘導(dǎo)H2O2、和MDA在菹草無菌苗體內(nèi)大量積累，產(chǎn)生了明顯的氧化脅迫.抗氧化酶(SOD、POD和CAT)和抗氧化劑(AsA、GSH、NP-SH和PCs)均能在一定范圍內(nèi)降低體內(nèi)活性氧的過量積累，但隨著脅迫濃度的增加，Ni2+最終使抗氧化系統(tǒng)發(fā)生紊亂，進(jìn)而對菹草生理和生化反應(yīng)造成整體傷害，破壞了植物的正常生理代謝.同時(shí)，菹草通過依次激活鳥氨酸途徑和谷氨酸途徑的關(guān)鍵酶來增加脯氨酸的含量，在抵抗鎳脅迫造成的植物毒害的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用.

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