寧采亭，蔡穎，劉遂心，謝康玲，張文亮，劉元

隨著高脂飲食和缺少運(yùn)動(dòng)的生活方式越來越常見，流行病學(xué)調(diào)查顯示，以胰島素抵抗(insulin resistance,IR)為核心的心腦血管疾病已成為影響人類健康和生命最主要的非傳染性疾病[1]。近年來，大量研究初步表明，運(yùn)動(dòng)可以改善IR；而瘦素抵抗在IR發(fā)生中起著重要作用[2]。我們的前期臨床研究證明，運(yùn)動(dòng)可以降低代謝綜合征患者的血清高瘦素水平[3]。本研究觀察在IR狀態(tài)下血清瘦素水平和組織瘦素受體表達(dá)的變化，以及運(yùn)動(dòng)對(duì)它們的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組 8周齡雄性SD大鼠，體重160~200 g，中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)部。選9只大鼠普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組。其他大鼠予高脂高糖飲食喂養(yǎng)6周造模。造模結(jié)束后48 h，對(duì)照組和造模組大鼠均禁食12 h過夜，于次日尾靜脈采血1 ml，放免法測(cè)空腹胰島素，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)。

ISI=ln[1/(FBG×FINS)]

將IR造模成功的34只大鼠隨機(jī)分為4組，各組繼續(xù)予以高脂高糖飲食喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束：①模型組(n=9)：僅予高脂高糖飲食喂養(yǎng)6周；②運(yùn)動(dòng)組(n=9)：予游泳訓(xùn)練[5]6周：保持水溫(33±2)℃，水深50 cm，每只大鼠的活動(dòng)面積200 cm2，第1周每天適應(yīng)性訓(xùn)練30 min，以后每天訓(xùn)練60 min，每周訓(xùn)練5 d；③二甲雙胍組(n=8)：予二甲雙胍300 mg/kg·d灌胃6周；④聯(lián)合組(n=8)：予二甲雙胍灌胃和游泳訓(xùn)練6周，具體方法同二甲雙胍組及運(yùn)動(dòng)組。

1.2 標(biāo)本的采集 各組大鼠在干預(yù)6周后使用剪尾法采血1滴，快速血糖儀測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)。干預(yù)結(jié)束后48 h，ES-1100型電子秤測(cè)量大鼠體重。大鼠麻醉，剪斷頸動(dòng)脈，迅速取血置無菌試管中，4℃下4000 r/min離心10 min，分離血清，-70℃保存。

放血處死大鼠。無菌條件下迅速于肝右葉、右后肢大腿骨骼肌和大網(wǎng)膜脂肪組織分別剪取約3×3×3 mm組織，液氮保存，用于RT-PCR檢測(cè)；另剪取約5×5×5 mm組織用于免疫組化染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 FPG、胰島素 放射免疫法測(cè)空腹胰島素(FINS)。HOMA法計(jì)算IR指數(shù)(IRI)：

IRI=-FPG(mmol/L)×FINS(mIU/ml)/22.5

1.3.2 血清瘦素水平 采用ELISA法。待測(cè)血清與室溫平衡后，PBS緩沖液1∶5稀釋；將4000 pg/ml、2000 pg/ml、1000 pg/ml、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各 100 μl依次加入 7 孔中，1孔加樣品稀釋液100 μl作為零孔，1孔為TMB空白顯色孔。每孔加入稀釋后待測(cè)血清，37℃水浴90 min；甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體；每孔加入生物素抗大鼠瘦素抗體工作液100 μl(TMB空白顯色孔除外)，37℃水浴60 min；每孔加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液100 μl(TMB空白顯色孔除外)，37℃水浴30 min；37℃平衡TMB顯色避光反應(yīng)30 min。用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定光密度(OD)值。

1.3.3 瘦素受體蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法。留取的組織生理鹽水沖洗，10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2處理，熱修復(fù)抗原；滴加5%山羊血清封閉液，滴加1∶150兔抗瘦素受體IgG，4℃過夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，室溫20 min；滴加SABC，室溫20 min。DAB顯色；蘇木精復(fù)染。用Image pro-Plus圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色圖像進(jìn)行定量分析。

1.3.4 瘦素受體mRNA表達(dá) 內(nèi)參比法采用RT-PCR。引物根據(jù)GeneBank中查得大鼠目的基因mRNA序列，再通過Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)時(shí)均跨越了1個(gè)內(nèi)含子，以使cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與可能污染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)別開來。β-actin和瘦素受體引物序列見表1。

表1 β-actin和瘦素受體引物序列

組織勻漿、分相，沉淀RNA，洗滌和溶解；檢測(cè)總RNA純度、濃度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系20μl，42℃反應(yīng)1 h，70℃ 10 min。cDNA于-20℃保存。PCR：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min。循環(huán)32次。72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。半定量分析：2.5%瓊脂糖凝膠中加入溴乙啶10 mg/ml，使其終濃度為0.5 μg/ml，成膠后置于電泳槽，加入0.5×TBE緩沖液，取PCR產(chǎn)物5μl與載樣緩沖液1μl混勻點(diǎn)樣，在60 V恒壓下電泳40 min。TANON GIS2020凝膠分析儀數(shù)碼拍照，BandScan V5.0軟件掃描，分析OD值，并與β-actin測(cè)定比值。

2 結(jié)果

2.1 體重、FPG、FINS、IRI及血清瘦素 與對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、FPG、FINS、血清瘦素明顯升高(P<0.01)，IRI明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組、運(yùn)動(dòng)組、聯(lián)合組大鼠體重、FPG、FINS、瘦素降低(P<0.05)，IRI升高(P<0.05)；與二甲雙胍組和運(yùn)動(dòng)組比較，聯(lián)合組大鼠IRI明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.2 組織瘦素受體蛋白 在肝臟、骨骼肌及脂肪組織中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠瘦素受體蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，脂肪組織中二甲雙胍組表達(dá)也明顯升高(P<0.01)；與二甲雙胍組比較，肝臟及脂肪組織中運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)，骨骼肌中聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)。見表3。

2.3 組織瘦素受體mRNA表達(dá) 在肝臟、骨骼肌及脂肪組織中，與對(duì)照組比較，模型組瘦素受體mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)，脂肪組織中，二甲雙胍組表達(dá)也升高(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，骨骼肌中，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見表4。比較，P<0.05。

表2 干預(yù)后各組體重、FPG、FINS、IRI及血清瘦素比較

表3 各組肝臟、骨骼肌、脂肪組織中瘦素受體蛋白表達(dá)比較(OD)

表4 各組肝臟、骨骼肌、脂肪組織中瘦素受體mRNA表達(dá)比較(相對(duì)OD)

2.4 相關(guān)分析 IRI與血清瘦素水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.807,P=0.000)，與瘦素受體蛋白呈正相關(guān)(r=0.776,P=0.002)。

3 討論

IR是引起糖尿病、高血壓、冠心病等代謝綜合征相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。大規(guī)模臨床研究證實(shí)，以運(yùn)動(dòng)為主的生活方式干預(yù)能夠明顯改善IR患者病程進(jìn)展，并減少發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。合理的行為干預(yù)(飲食、運(yùn)動(dòng))可有效降低IR，從而減少由其引發(fā)的代謝異常[5,7-8]。本研究顯示，運(yùn)動(dòng)能夠明顯改善IR，主要表現(xiàn)為體重減輕，空腹胰島素、空腹血糖水平下降，IRI升高。

瘦素是肥胖基因編碼的一種分泌型蛋白質(zhì)，因其基本作用是使動(dòng)物體重降低而得名。瘦素受體存在于包括下丘腦、肝臟、骨骼肌及脂肪組織在內(nèi)的許多組織器官中[9]。本研究顯示，IR模型大鼠血清瘦素明顯升高，瘦素受體蛋白和mRNA表達(dá)下降，并與IRI相關(guān)。有研究顯示，瘦素可直接作用于胰島細(xì)胞瘦素受體，抑制胰島素的分泌，從而減少脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解[10-11]；瘦素受體表達(dá)下降，盡管循環(huán)中瘦素水平高，但效應(yīng)減低，形成所謂瘦素抵抗[12-14]。組織瘦素受體表達(dá)減弱是造成IR的主要原因[7]。

本研究顯示，二甲雙胍和運(yùn)動(dòng)均能降低血清瘦素水平，上調(diào)組織中瘦素受體表達(dá)。與二甲雙胍組比較，運(yùn)動(dòng)上調(diào)瘦素受體作用似更強(qiáng)。

本研究顯示，運(yùn)動(dòng)組FPG、FINS及IRI水平與二甲雙胍組比較無顯著性差異，提示還存在改善IR的其他機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，IR大鼠存在明顯的高瘦素血癥與瘦素受體表達(dá)下調(diào)，并與IR密切相關(guān)。運(yùn)動(dòng)可以降低胰島素大鼠血清瘦素和上調(diào)組織瘦素受體的表達(dá)，緩解瘦素抵抗，這可能是運(yùn)動(dòng)改善IR的機(jī)制之一。

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