苑愛云，蔣莉，侯梅，李欣

國內(nèi)外動物實驗均證實，持續(xù)驚厥發(fā)作將導致選擇性海馬區(qū)神經(jīng)元死亡，產(chǎn)生不可逆性腦損傷。大量實驗提示，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)元生長、存活的必需因子。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF對驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsivus,SC)后海馬神經(jīng)元的凋亡有一定抑制作用[1-2]。本研究觀察外源性BDNF對驚厥后大鼠海馬凋亡調(diào)控基因表達的影響，探討B(tài)DNF對驚厥性腦損傷可能的調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 模型制備和分組 健康成年Wistar大鼠64只，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。其中32只采用氯化鋰-匹羅卡品(SIGMA公司)腹腔注射誘發(fā)SC模型(SC)[3]。在驚厥發(fā)作30 min后腹腔注射水合氯醛(上海禾豐制藥有限公司)300 mg/kg止驚。另32只為正常對照組(NC)。所有大鼠行側(cè)腦室內(nèi)注射，根據(jù)注射內(nèi)容不同，進一步分為生理鹽水(NS)注射組、BDNF注射組、抗BDNF抗體注射組(美國PEPROTECH公司)和無注射組，每組8只。

1.2 腦室內(nèi)注射 按鼠腦解剖圖譜確定側(cè)腦室定位參數(shù)。在前囟尾側(cè)3.7 mm、中線左側(cè)4.1 mm、顱骨表面以下5.5 mm為定向部位，手術(shù)刀尖鉆透顱骨后，10 μl微量注射器緩慢注入 0.1 μg/μl BDNF 4 μl(SC-或NC-BDNF 組)、200 μg/ml抗 BDNF 抗 體 2 μl(SC-或NC-抗BDNF組)或者生理鹽水2 μl(SC-或NC-NS組)，于10~15 min內(nèi)注射完畢，留針2 min后拔出注射器。右側(cè)海馬未做處理。

腦室內(nèi)注射后6 h(為SC后海馬細胞凋亡早期事件變化最明顯時點[4])斷頭取腦，取雙側(cè)海馬，分別留取約50 mg海馬組織；余海馬組織分別采用免疫組化和原位雜交(In Situ Hybridization,ISH)觀察bcl-2蛋白/mRNA、c-jun蛋白/mRNA的分布，并進行半定量分析。

1.3 免疫組化檢測 海馬連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚8 μm，按SP法進行免疫組化染色(兔抗鼠bcl-2、c-jun多抗及SP免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司)。每只大鼠取3張切片，分別在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回各隨機取3個視野(20×10)，應用北航CM-2000B型生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定其平均光密度(OD)。

1.4 原位雜交 取與免疫組化相鄰的腦組織切片原位雜交觀察bcl-2和c-jun mRNA的表達(bcl-2、c-jun原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司)。測定每張切片的OD。

1.5 RT-PCR檢測 對預留的50 mg海馬組織，采用RT-PCR檢測bcl-2和c-jun mRNA的表達(RNA提取試劑盒和RT-PCR檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)。引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定擴增產(chǎn)物條帶平均光密度。將bcl-2、c-jun條帶OD值與相應β-actin光密度值比較，計算平均OD比值。

表1 RT-PCR引物序列及長度

2 結(jié)果

2.1 bcl-2 在注射(左)側(cè)，NC各組海馬c-jun蛋白和mRNA表達均無顯著性差異；SC各組中，bcl-2蛋白和mRNA表達由高到低依次為：BDNF組>無注射組=NS組>抗BDNF組(α=0.05)。注射對(右)側(cè)，海馬bcl-2蛋白和mRNA表達各組無顯著性差異。見表2~表4。

2.2 c-jun 在注射(左)側(cè)，NC組中，NS組、抗BDNF組海馬bcl-2蛋白和mRNA表達較其他兩組增高；SC各組中，c-jun蛋白和mRNA表達由高到低依次為：抗BDNF組>NS組>BDNF組=無注射組(α=0.05)。注射對(右)側(cè)，NC各組海馬c-jun蛋白和mRNA表達無顯著性差異，SC各組海馬c-jun蛋白和mRNA表達也無顯著性差異，但均高于NC-無注射組。見表5~表7。

表2 各大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(OD)

表3 各大鼠海馬bcl-2 mRNA表達(RT-PCR法，OD比值)

表4 各大鼠海馬bcl-2 mRNA表達(ISH法，OD)

表5 各大鼠海馬c-Jun蛋白表達(OD)

表6 各大鼠海馬c-jun mRNA表達(RT-PCR法，OD比值)

表7 各大鼠海馬c-jun mRNA表達(ISH法，OD)

3 討論

BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族的重要成員，與神經(jīng)元的生長、再生密切相關(guān)。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，BDNF可以抑制SC后海馬神經(jīng)元的凋亡[2]，本研究進一步在凋亡調(diào)控基因的水平探討B(tài)DNF對驚厥性腦損傷的作用及其調(diào)控機制。

凋亡是細胞受基因調(diào)控的程序性死亡過程，c-jun和bcl-2均是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因。bcl-2與細胞凋亡密切相關(guān)，具有“主開關(guān)”的作用[5]。bcl-2編碼的蛋白具有線粒體膜穩(wěn)定功能，可阻止線粒體凋亡早期因子的釋放，抑制細胞凋亡過程。因此，bcl-2被認為是細胞凋亡中的潛在抑制因子。c-jun編碼的蛋白在正常情況下可參與細胞生長、發(fā)育、分化等生理過程；病理狀況下，可通過對bcl-2家族的抑制，促進線粒體功能障礙，誘導細胞凋亡[6]。

大量研究證實，BDNF可減輕和阻止癲癇發(fā)作，對腦損傷具有保護作用[1-2,7]。bcl-2家族的調(diào)節(jié)可能是BDNF抵抗神經(jīng)元凋亡的機制之一[1]；BDNF還可抑制c-jun的活化[8]。Jeanneteau等證實，BDNF可通過促分裂素原活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)引起c-jun氨基末端激酶(JNK)的滅活[9]。新生鼠視皮質(zhì)切除后可引起背側(cè)膝狀體快速而幾乎完全的神經(jīng)元變性，外源性BDNF可以顯著削弱上述神經(jīng)元病變[10]。

本組研究顯示，在誘發(fā)SC后，注射BDNF可上調(diào)注射側(cè)海馬bcl-2表達，下調(diào)c-jun表達；而注射抗BDNF抗體能對抗這一作用。提示對凋亡調(diào)控基因的調(diào)節(jié)可能是BDNF腦損傷作用的機制之一。

本研究還顯示，注射對側(cè)海馬bcl-2及c-jun的表達無顯著改變，提示腦室內(nèi)注射BDNF，其在腦內(nèi)擴散有限。由于腦室內(nèi)注射為有創(chuàng)損傷，且臨床操作困難、實用性差，在臨床的應用受到限制。而BDNF易被肝臟攝取滅活，且難以通過血腦屏障，經(jīng)口服或外周血管給藥均不能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。促進內(nèi)源性BDNF表達，尋找更安全、方便的給藥途徑，將成為今后研究的重點。

[1]Almeida RD,Manadas BJ,Melo CV,et al.Neuroprotection by BDNF against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathways[J].Cell Death Differ,2005,12(10):1329-1343.

[2]胡越,蔣莉,李欣.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對大鼠驚厥性腦損傷的作用及調(diào)控因素[J].中國循證兒科雜志,2008,3(3):208-211.

[3]胡越,蔣莉.有效控制氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的實驗研究[J].兒科藥學雜志,2003,9:5-8.

[4]苑愛云,蔣莉,王貞,等.年齡和驚厥持續(xù)時間對持續(xù)驚厥后大鼠海馬細胞線粒體膜電位的影響[J].中國康復理論與實踐,2010,16(11):1027-1029.

[5]Martinou JC,Youle RJ.Mitochondria in apoptosis:Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J].Dev Cell,2011,21(1):92-101.

[6]Schenkel J.Activation of the c-Jun transcription factor following neurodegeneration in vivo[J].Neurosci Lett,2004,361(1-3):36-39.

[7]Isokawa M.N-methyl-D-aspartic acid-induced and Ca-dependent neuronal swelling and its retardation by brain-derived neurotrophic factor in the epileptic hippocampus[J].Neuroscience,2005,131(4):801-812.

[8]Yamagishi S,Matsumoto T,Yokomaku D,et al.Comparison of inhibitory effects of brain-derived neurotrophic factor and insulin-like growth factor on low potassium-induced apoptosis and activation of p38 MAPK and c-Jun in cultured cerebellar granule neurons[J].Brain Res Mol Brain Res,2003,119(2):184-191.

[9]Jeanneteau F,Deinhardt K,Miyoshi G,et al.The MAP kinase phosphatase MKP-1 regulates BDNF-induced axon branching[J].Nat Neurosci,2010,13(11):1373-1379.

[10]Madeddu F,Naska S,Bozzi Y.BDNF down-regulates the caspase 3 pathway in injured geniculo-cortical neurones[J].Neuroreport,2004,15(13):2045-2049.