貢 嘎，查 果，拉 珍，索朗斯珠

（西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝860000）

豬沙門菌在自然界中十分普遍，是由豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等引起仔豬的一種傳染病。本病一年四季均可發(fā)生，但以多雨潮濕季節(jié)發(fā)病較多，多與其他病毒，如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒混合感染，混合感染時(shí)導(dǎo)致發(fā)病率與死亡率增高［1－3］。

2012年6月份，西藏地區(qū)某藏豬養(yǎng)殖場(chǎng)的豬體溫突然升高，隨后呼吸困難，耳根、腹下皮膚有紅色斑點(diǎn)等癥狀。病死豬剖檢可見脾臟顯著腫大、出血，肝、腎有不同程度的腫大、充血、出血，肺臟整個(gè)呈干酪樣等病變。

1 材料與方法

1．1 病料 西藏地區(qū)某藏豬養(yǎng)殖場(chǎng)病死豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買10只SPF級(jí)4周齡Balb／C小鼠，雌雄各半。

1．3 主要試劑 普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血平板、普通肉湯、三糖鐵斜面及各生化培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室制備［4］。

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，多功能DNA純化回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Omega公司；2×powerTaqPCR MasterMix，購(gòu)自上海東勝有限公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18－T，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1．4 細(xì)菌的分離與鑒定 無(wú)菌采取病死藏豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)做為病料涂片，革蘭染色鏡檢。

無(wú)菌采集自然病死藏豬的心血、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)分別接種普通平板、血平板、麥康凱瓊脂平板，分別37℃培養(yǎng)24h，從中分離到1株疑似沙門菌的革蘭陰性直桿菌。取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。

取分離菌株的純培養(yǎng)物接種生化培養(yǎng)基，設(shè)對(duì)照組。將試驗(yàn)管與對(duì)照管同時(shí)置37℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

PCR鑒定：引物設(shè)計(jì)根據(jù)沙門菌argT基因保守序列設(shè)計(jì)一套引物，序列如下：S1：5′－ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG－3′；S2：5′－TGTTGTCCT GCCCCTGGTAAGAGA－3′，擴(kuò)增目的片段為495bp。

細(xì)菌DNA提取與PCR：提取DNA嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用普通PCR擴(kuò)增。陽(yáng)性條帶割膠，經(jīng)純化后連入pMD18－T載體，克隆測(cè)序。

PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

1．5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組用18h肉湯培養(yǎng)物給小鼠灌胃，0．2mL／只；對(duì)照組用普通肉湯0．2 mL／只給小鼠灌胃。

1．6 藥物敏感性試驗(yàn) 用滅菌涂棒將普通肉湯培養(yǎng)物均勻致密地涂布于普通瓊脂平板，將藥敏紙片貼壓于平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 鏡檢及分離培養(yǎng) 鏡檢可見1株革蘭陰性直桿菌、有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢及莢膜；在普通平板上生長(zhǎng)菌落細(xì)小、圓形、凸起、光滑、邊緣整齊；在麥康凱瓊脂平皿上，菌落細(xì)小、邊緣整齊、光滑凸起；在血平板上生長(zhǎng)大菌落、凸起、暗白色、不溶血、邊緣整齊。

2．2 生化結(jié)果 見表1。

表1 生化鑒定

2．3 PCR鑒定 在生化鑒定的基礎(chǔ)上，分離菌PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在含1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可以見到1條清晰的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符。擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行序列分析比對(duì)，結(jié)果與鼠傷寒沙門菌的基因序列同源性達(dá)到100%，確定為鼠傷寒沙門菌（見圖1）。

2．4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 4周齡Balb／C小鼠隨機(jī)分2組，每組5只，試驗(yàn)組小鼠灌胃菌液后的8h后發(fā)病，精神委靡、食欲下降或不食，18h開始出現(xiàn)死亡。剖檢觀察，可見脾臟顯著腫大，肝臟出血，有小壞死點(diǎn)，肺臟有出血點(diǎn)、變脆，腎臟腫大。從死亡小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中均能分離出與感染細(xì)菌相似的細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定與所分離出的菌一致。對(duì)照組小鼠仍存活。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2．5 藥物敏感性試驗(yàn) 該菌株對(duì)臨床常用藥物如鏈霉素、四環(huán)素、青霉素、壯觀霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素均無(wú)作用，對(duì)紅霉素、頭孢拉定低度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明高度敏感。

3 討論

本試驗(yàn)從西藏地區(qū)某藏豬養(yǎng)殖基地病死藏豬體內(nèi)分離到1株革蘭陰性直桿菌，經(jīng)生化及PCR鑒定為豬鼠傷寒沙門菌。

胡新崗等報(bào)道［5］，試驗(yàn)小鼠接種分離的鼠傷寒沙門菌培養(yǎng)物后24h內(nèi)出現(xiàn)死亡，這與本次小鼠菌液灌胃后的8h后發(fā)病，18h開始出現(xiàn)死亡均一致。

本次分離的菌株耐藥性較強(qiáng)。藥敏試驗(yàn)的10種常用抗生素中大部分都對(duì)該菌株不敏感，對(duì)紅霉素、頭孢拉定低度敏感，只對(duì)環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明高度敏感?？梢姴刎i對(duì)沙門菌的耐藥性較嚴(yán)重，這可能藏區(qū)飼養(yǎng)藏豬過程中大量使用或?yàn)E用抗生素的后果，提醒飼養(yǎng)人員今后在使用抗生素等藥物時(shí)慎重選擇。

［1］ 湯景元，姜平，鄧雨修，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒和致病性沙門菌的混合感染［J］．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25（4）：337－338．

［2］ 林進(jìn)秋，李沐華．豬圓環(huán)病毒2型和致病性沙門菌的混合感染［J］．廣東畜牧獸醫(yī)科技，2005，30（6）：33－34．

［3］ 侯洪烈．豬沙門菌和豬瘟混合感染的診治［J］．畜牧與獸醫(yī)，2002，34（10）：23－24．

［4］ 姚火春．獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：36－42．

［5］ 胡新崗，黃銀云，郭廣富，等．豬鼠傷寒沙門菌的分離與鑒定［J］．畜牧與獸醫(yī)，2005，37（11）：44－45．