呂九云，張彥龍

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

犬瘟熱病毒（CDV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，是一種具有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，它能導(dǎo)致犬科、鼬科、浣熊科、大型貓科和淡水海豹等發(fā)病，以高度致死性且不具有免疫保護(hù)為感染性特點(diǎn)［1－2］。對(duì)于毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)，犬瘟熱一直沒(méi)有得到很好的控制，它常導(dǎo)致60%～100%的死亡率，對(duì)發(fā)病地區(qū)毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)造成了近乎毀滅性的打擊，特別是近幾年，呈現(xiàn)了已免疫的毛皮動(dòng)物種群仍然大規(guī)模發(fā)病的新流行特點(diǎn)［3］。烏蘇里貉在毛皮動(dòng)物中對(duì)犬瘟熱最為敏感，很多用于預(yù)防犬、狐貍等動(dòng)物的犬瘟熱疫苗不適合烏蘇里貉犬瘟熱的預(yù)防，研究適合

烏蘇里貉犬瘟熱防治的疫苗擺在我們面前。因此，具有較高免疫原性的貉源犬瘟熱弱毒對(duì)于貉子犬瘟熱的防治具有重要意義，本試驗(yàn)另辟途徑，從未發(fā)病的貉子中分離毒株進(jìn)而為貉源犬瘟熱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌株、毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）本室保存；E．coliDH5α宿主菌，購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；試驗(yàn)用烏蘇里貉，黑龍江省哈爾濱市周邊養(yǎng)殖場(chǎng)。

1．2 主要試劑和儀器 膠回收試劑盒，TaqDNA聚合酶，dNTP，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；隨機(jī)六聚體引物 （Random Primer）、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker DL－2 000、pMD18－T Vector，購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（GIBICOCat．No．12100－038），購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清（FBS）Gibco．Cat．No．10099－141；0．25%胰蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)室保存；0．22μm 微孔濾膜；TI－SM 倒置顯微鏡（Nikon E－clipse TS100）；MCO－18AIC （UV）CO2培 養(yǎng) 箱（SANYO Electric CO．Led made in JAPAN）；2700型PCR儀（美國(guó) ABI公司）等儀器；CO2（99．99%），哈爾濱黎明氣體有限公司；ULTROSPEC 1100pro型紫分光光度計(jì)（GE Healthcare，美國(guó)）。

1．3 病毒的分離培養(yǎng)

1．3．1 分離病毒 自2006年至2009年，每年的11～12月份，將大量打皮期的烏蘇里貉的肺臟小心取出，剪去上部氣管，插入無(wú)菌注射器，灌注PBS，輕輕按摩肺臟，自氣管倒出收集，反復(fù)3次，離心收集細(xì)胞，加入適量DMEM后，肺臟巨噬細(xì)胞反復(fù)凍融3次，過(guò)濾除菌備用。

1．3．2 應(yīng)用ELISA篩選陽(yáng)性樣本 巨噬細(xì)胞凍存液100μL，過(guò)夜包被在ELISA板上；次日3%牛血清白蛋白封閉1h，PBST洗滌3次，5min／次；加自制的狐血清的犬瘟熱多克隆抗體，室溫孵育1h，洗滌3～4次，5min／次；然后加鼠抗狐IgG單克隆抗體，室溫孵育1h，洗滌3～4次，5min／次；最后加兔抗鼠酶標(biāo)抗體，室溫孵育1h，洗滌5次，5min／次；加聯(lián)苯二胺顯色5min，加3NHCl終止反應(yīng)，目測(cè)陽(yáng)性樣本。

1．3．3 病毒培養(yǎng) 在37℃下培養(yǎng)Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)3～4d后傳代培養(yǎng)，一般按1傳3或4傳代，同步接種樣本毒，在37℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞變化，并與正常作對(duì)照觀察。盲傳5代沒(méi)有病變的陰性丟棄，陽(yáng)性樣本應(yīng)用RT－PCR鑒定。

1．3．4 蝕斑克隆分離單個(gè)毒株 在Vero細(xì)胞中同步接種分離的病毒，接毒10h后，加入血清含量為2%無(wú)酚紅DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂，第5天后，加入含中性紅的DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂染色，第6天，便形成蝕斑，挑取大小不同的蝕斑，克隆3次后選擇中等蝕斑克隆大小（0．5～0．8mm）的毒株。經(jīng)蝕斑克隆分離后，再繼代培養(yǎng)病毒，直到穩(wěn)定的細(xì)胞病變產(chǎn)生為止。

1．4 分離病毒RT－PCR鑒定

1．4．1 引物設(shè)計(jì)與合成 由犬瘟熱病毒F基因保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物進(jìn)行病毒鑒定，預(yù)期擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為324bp。F1：5′－ACTTGCAGGTGTAGCTTTAGG－3′；F2：5′－AATACGATCACGTAAACTCGG－3′。根據(jù) CDV Onderstepoort株 F基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為1 053bp。F3：5′－GGG TACCTCCAACCTCAATGCTCAAG－3′；F4：5′－CGGATC CAGAGCGCCTAACCGTCTC－3′［5］。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．4．2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參照RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取總的RNA?？俁NA 5μL，隨機(jī)六聚體引物1μL，70℃保溫10min后迅速在冰上急冷2min以上。上述模板6μL，5×M－MLV Buffer 2μL，dNTP Mixture（10mmol／L）0．5μL，RTase M－MLV（RNase H－）0．8μL，加 DEPC水至10μL。反轉(zhuǎn)錄條件42℃保溫1h，70℃保溫15min后冰上冷卻，得到cDNA溶液。

1．4．3 病毒cDNA的PCR擴(kuò)增 總反應(yīng)體系25 μL：Taq（5U／μL）0．5μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，上下游引物各1μL，dNTP Mixture（2．5mmol／L）2．5μL，模板3μL，ddH2O 14．5μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃熱變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1．4．4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在投射紫外燈下觀察并照相［6］。同時(shí)進(jìn)行膠回收，將PCR擴(kuò)增片段克隆進(jìn)pMD18－T中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后送去上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．5 病毒感染力（TCID50）測(cè)定 測(cè)定5、10、15代毒的TCID50，在1．5mL離心管中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋?zhuān)瑥?0－1～10－10。將稀釋好的病毒接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μL。在每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，使細(xì)胞量達(dá)到2～3×105個(gè)／mL。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排（100μL生長(zhǎng)液＋100 μL細(xì)胞懸液）。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察3～5d。

1．6 血清中和試驗(yàn) 取該毒株細(xì)胞培養(yǎng)物5mL，加入CDV陽(yáng)性血清1．2mL，混勻．置37℃感作1 h，取感作后的細(xì)胞培養(yǎng)物接種Vero細(xì)胞單層兩瓶，接種量為細(xì)胞培養(yǎng)液的10%，于37℃中培養(yǎng)，設(shè)未中和的細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)照兩瓶，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照兩瓶，逐日觀察CPE情況。

2 結(jié)果

2．1 病毒的分離 在接毒細(xì)胞的前3代沒(méi)有出現(xiàn)明顯病變，但盲傳至第4～5代時(shí)，出現(xiàn)規(guī)律性細(xì)胞融合。如圖1所示在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間出現(xiàn)的細(xì)胞病變。

2．2 蝕斑克隆結(jié)果 克隆3次，直徑0．3～0．5，0．5～0．8及0．7～0．9mm 的克隆株各1個(gè)，經(jīng)TCID50鑒定 ，0．1mL TCID50均在104．5以上。

2．3 RT－PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果 用引物F1、F2對(duì)病毒株CDV／R－20／12的細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的電泳條帶約324bp（圖2），表明此毒株為犬瘟熱病毒。

2．4 F基因測(cè)序結(jié)果 用犬瘟熱引物F3、F4對(duì)病毒株CDV／R－20／12的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)出1條1 053bp的電泳條帶（圖3），PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆后測(cè)序，所得序列（圖4）與GenBank的CDV序列進(jìn)行比對(duì)，證明所得的毒株序列確實(shí)是CDV病毒序列。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)病變情況

2．5 病毒感染力測(cè)定結(jié)果 按Reed－Muench的計(jì)算方法，計(jì)算前10代病毒的TCID50，計(jì)算結(jié)果如下表（表1）。

2．6 血清中和試驗(yàn)結(jié)果 用CDV參考陽(yáng)性血清與該毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果該分離株可被完全中和，未中和的培養(yǎng)物對(duì)照兩瓶均病變，正常細(xì)胞均未病變，表明該分離毒株為CDV。

3 討論

本試驗(yàn)在貉取皮期，在未發(fā)病的烏蘇里貉養(yǎng)殖場(chǎng)中，從肺臟和腹水中收集巨噬細(xì)胞，應(yīng)用ELISA篩選犬瘟熱陽(yáng)性樣本，通過(guò)Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)，能看出典型CPE，經(jīng)蝕斑克隆純化，RT－PCR鑒定以及血清學(xué)試驗(yàn)，證明獲得1株犬瘟熱毒株。病毒經(jīng)20代傳代培養(yǎng)，可以在Vero細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)，TCID50維持在104．5～5．5／0．1mL之間。

目前對(duì)CDV感染的動(dòng)物還沒(méi)有特異的治療方法，目前對(duì)家犬犬瘟熱的治療多采用對(duì)癥治療、抗犬瘟熱血清和單克隆抗體法進(jìn)行治療。但是，對(duì)于毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，這種治療方法不夠經(jīng)濟(jì)，不能夠普及利用［1］。因此，研制有效的疫苗顯得尤為重要，本試驗(yàn)中分離的毒株并未導(dǎo)致貉子發(fā)病，需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)研究，從而確定該毒株是否為弱毒株，進(jìn)而為貉源犬瘟熱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

圖4 CDV分離毒株F蛋白基因部分序列

表1 Vero細(xì)胞病毒液1～10代的TCID50

［1］ 譚婷婷，張立恒，劉志平，等．狐源性犬瘟熱病毒抗血清的制備及其初步應(yīng)用［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：73－74．

［2］ Dal Pozzo Fabiana，Galligioni Viola，Vaccari Francesca，etal．Antiviral efficacy of EICAR against canine distemper virus（CDV）in vitro［J］．Research in Veterinary Science，2010，88：339－344．

［3］ 劉瀾瀾，華育平，曾祥偉，等．狐貉源犬瘟熱病毒核蛋白基因的克隆及序列比較分析［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35（9）：61－63．

［4］ Lan N T，Yamaguchi R，Kawabata A，etal．Stability of canine distemper virus （CDV）after 20passages in Vero－DST cells expressing the receptor protein for CDV ［J］．Veterinary Microbiology，2006，118：177－188．

［5］ 蘇鳳艷，魏吉祥，王卓聰，等．犬瘟熱病毒水貂株的分離與鑒定［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（2）：79－82．

［6］ 蘇鳳艷，宗春苗，王卓聰，等．水貂源犬瘟熱病毒的分離鑒定［J］．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（6）：674－677．

［7］ 葉俊華，夏咸柱，徐玉生，等．．幾種犬瘟熱弱毒疫苗免疫效果比較研究［J］．江西畜牧獸醫(yī)雜志，2003，2：37－38．