史秋梅，張艷英，高桂生，高光平，邵新華，梁銀聚，劉會(huì)然

（1．河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 昌黎066600；2．河北新華科級(jí)獸藥有限公司，河北 欒城051430）

奶牛乳房炎是世界乳牛業(yè)的主要危害因素之一，無乳鏈球菌是牛群中乳腺炎的重要傳染性病原菌，對(duì)規(guī)模飼養(yǎng)的奶牛，其危害是相當(dāng)嚴(yán)重的。試驗(yàn)證明［1］，犢牛時(shí)期飼喂含有無乳鏈球菌的乳汁，并在同欄飼養(yǎng)到產(chǎn)犢時(shí)，無乳鏈球菌性乳腺炎的發(fā)病率很高。據(jù)報(bào)道［2］，無乳鏈球菌可引起新生兒敗血癥、腦膜炎、呼吸道和婦女生殖感染等。目前無乳鏈球菌對(duì)奶牛業(yè)和人的健康帶來的危害已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)在檢測(cè)致病菌方面得以廣泛應(yīng)用，并且展現(xiàn)出其快速、特異的優(yōu)勢(shì)和前景。國(guó)內(nèi)外對(duì)無乳鏈球菌的檢測(cè)方法已有一定的相關(guān)研究基礎(chǔ)。吳潤(rùn)等［3］利用已知無乳鏈球菌16SrRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR方法鑒定無乳鏈球菌。曹隨忠等［4］根據(jù)Gen－Bank中收錄的序列，參考無乳鏈球菌和停乳鏈球菌在16SrRNA與23SrRNA之間的間隔區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了特異性診斷方法。近年來，國(guó)內(nèi)或國(guó)外都較普遍采用易操作、快速的PCR無乳鏈球菌檢測(cè)方法［5］，國(guó)內(nèi)賈玉萍［6］等建立的巢式PCR方法，檢測(cè)無乳鏈球菌16SrRNA，可檢測(cè)到1CFU／mL的鏈球菌。這對(duì)于鏈球菌性乳房炎的早期預(yù)防及監(jiān)測(cè)具有重要意義。因此，本試驗(yàn)將傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定方法和PCR快速檢測(cè)方法相結(jié)合對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行鑒定，旨在為奶牛乳房炎的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌株 來自河北秦皇島周邊地區(qū)的某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，患乳房炎病牛的牛乳，菌株編號(hào)同奶牛編號(hào)。菌株數(shù)編號(hào)為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；奶牛編號(hào)依次為：2647、56、2、3089、0808、68303、0014、16635、52129、0547。無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（C55934）、豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（C55914），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1．2 主要試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)：20090808），6%兔鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂常規(guī)制備，營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)：2090120）LB營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)：010709），細(xì)菌生化鑒定試劑盒，均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。溶菌酶、蛋白酶K為Solarbio公司產(chǎn)品；Taqplus DNA Polymerase、dNTPs、Marker DL－600為 TaKaRa 公司產(chǎn)品；鏈球菌乳膠凝集標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒（Streptococcus Gruping kit），批號(hào)：786536601，為法國(guó)梅里埃（BioMerieux sa）公司產(chǎn)品。

1．3 主要儀器 TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY－103B），上海智城分析儀器制造有限公司；PCR擴(kuò)增儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1．4 奶樣采集 從河北秦皇島周邊地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，選取10頭牛的奶樣作為試驗(yàn)樣本。樣本牛選擇的標(biāo)準(zhǔn)：奶產(chǎn)量與以往比較有所下降；乳房和乳頭都無明顯臨床型乳房炎表現(xiàn)；未患傳染?。ㄈ缃Y(jié)核病、布魯菌病等）。每頭樣本奶牛采集奶樣10mL。采樣前，用溫水對(duì)乳房進(jìn)行清洗，然后用0．2%新潔爾滅擦洗，最后用75%酒精消毒乳頭。擠奶樣時(shí)，去掉頭2～3把奶以避免污染一些雜菌。將奶樣分別裝入滅菌的小瓶中，加蓋封緊，標(biāo)明牛號(hào)、乳室和日期，儲(chǔ)放冰盒送實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行檢測(cè)。

1．5 形態(tài)學(xué)檢查 將每份乳樣分別離心集菌，沉淀進(jìn)行涂片，革蘭染色后置于顯微鏡下觀察細(xì)菌的形狀、染色特性，初步判斷樣本中有無鏈球菌。

1．6 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將奶樣離心集菌，在無菌條件下取離心沉淀乳樣劃線接種于5%兔鮮血瓊脂中37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)。在兔鮮血瓊脂平板中挑取疑似菌落經(jīng)革蘭染色后鏡檢，同時(shí)挑取疑似菌落接種兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上純培養(yǎng)。

1．7 生化鑒定 無菌挑取上述純培養(yǎng)物，進(jìn)行以下項(xiàng)目的生化鑒定：過氧化氫酶試驗(yàn)、乳糖、七葉苷、甘露醇、水楊素、棉子糖、山梨糖、單糖、木糖、纖維二糖發(fā)酵試驗(yàn)等。

1．8 蘭氏分群 將上述待檢菌株接種于鮮血培養(yǎng)基，經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h，然后分離菌株選取2～3個(gè)菌落在含有0．4mL酶消化液的EP管內(nèi)，振蕩混勻，37℃恒溫孵育10min。將試劑盒內(nèi)的A、B、C、D、F、G型乳膠混勻后，分別取一滴滴在反應(yīng)卡片的相應(yīng)位置，再取消化好的菌液滴一滴于乳膠滴旁，用混勻棒將兩滴液體充分混勻，輕微晃動(dòng)2min后判定結(jié)果，如果出現(xiàn)明顯的凝集顆粒為陽性，如果出現(xiàn)凝集的均勻混懸液為陰性。并設(shè)生理鹽水空白對(duì)照、A～G群混合陽性抗原對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)無乳鏈球菌C55934、豬鏈球菌C55914株對(duì)照。

1．9 巢式PCR檢測(cè)

1．9．1 基因組DNA的提取 分別制備無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA、臨床分離菌株DNA模板。方法如下：挑取上述細(xì)菌純培養(yǎng)物的單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液并分裝于1．5mL離心管13 000r／min（4℃）離心30s，將菌體懸于400μL 50mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA）液，后加入50μL溶菌酶（1 000mg／mL）混勻放于37℃溫育30～60min，期間緩慢搖動(dòng)。然后加入250μL STEP溶液，50℃緩慢搖動(dòng)至少2h，分兩管做。0．7 mL溶液中加入1mL純化樹脂顛倒混勻5～6次，室溫下溫育3min其間顛倒混勻1次，5 000r／min離心3s，收集沉淀。用1mL GN結(jié)合液將純化樹脂顛混勻5 000r／min離心3s，收集沉淀。用0．5mL漂洗液漂洗純化樹脂兩次顛倒混勻5 000r／min離心，收集沉淀。用0．8mL乙醇懸浮純化樹脂裝入離心柱13 000r／min離心1min。然后倒掉收集管中的乙醇放入離心柱內(nèi)，轉(zhuǎn)速為13 000r／min離心1min，盡量除盡乙醇然后將純化柱套入干凈的1．5mL離心管中，開蓋放置2～3min，加入100mLTE緩沖液與純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫放置3min。13 000r／min離心2min，最后取2μL（1%瓊脂糖電泳）檢測(cè)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．9．2 擴(kuò)增 從GenBank中查得鏈球菌屬16S rRNA的序列，用DNAStar軟件進(jìn)行比較分析，在保守區(qū)設(shè)計(jì)鏈球菌屬的通用引物L(fēng)1和L2；在保守區(qū)之間，無乳鏈球菌的可變區(qū)設(shè)計(jì)特異引物A1和A2。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列：L1：5′－GCGTGCCTAATACATGCAA－3′；L2：5′－TACAAC－GCAGGTCCATCT－3′。A1：5′－TTTGGTGTTTACTAGACTG－3′；A2：5′－TGTGTTAATTACTCTTATGCG－3′。外側(cè)擴(kuò)增25μL體系用引物L(fēng)1和L2對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR混合液組成：10×PCR Buffer 2．5μL，4×dNTP 2μL（2．5 mmoL／μL），1μL（25mmoL／μL）MgCl2，引物 L1和L2各2μL（10pmoL／μL），rTaqDNA酶1．5U，模板2μL，加雙蒸水補(bǔ)足25μL。同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃變性4min，94℃45s，52℃45s，72℃45s，共25個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物5μL用1．0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。90V電泳30min，紫外燈下觀察結(jié)果。以DL－2 000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)側(cè)擴(kuò)增25μL體系用A1和A2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物2μL作為模板，反應(yīng)體系其他組成及條件同外側(cè)擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2．1 形態(tài)學(xué)檢查 菌落較小，呈β型溶血。經(jīng)革蘭染色后鏡檢可見菌體呈圓形或卵圓形，排列成短鏈狀，革蘭染色陽性。

2．2 生化鑒定 各項(xiàng)生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

無乳鏈球菌易溶解過氧化氫酶，能發(fā)酵乳糖呈陽性，在6．5%NaCl中不生長(zhǎng)，七葉苷、甘露醇、山梨醇、棉子糖、水楊素呈陰性。碳源與氮源利用方面：根據(jù)該試驗(yàn)判斷出6株菌為B群鏈球菌，符合無乳鏈球菌的特征。因此2547、2、68303、3089、56、0808編號(hào)的細(xì)菌為無乳鏈球菌。

2．3 蘭氏分群 各菌株分群結(jié)果見表2。

表1 無乳鏈球菌生化鑒定

表2 各菌株分群

通過蘭氏分群試驗(yàn)證明其細(xì)菌是B群的有2547、56、2、3089、0808、68303。上述編號(hào)均為無乳鏈球菌。其中68303為微弱凝集的B群。標(biāo)準(zhǔn)菌株無乳鏈球菌C．55934為蘭氏B群，豬鏈球菌C55914為蘭氏D群。

2．4 基因組DNA的提取 通過電泳觀察得出提取的菌株基因組DNA帶整齊、大小一致。通過采用巢式PCR檢測(cè)，用引物L(fēng)1和L2外側(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物，分離株2547、2、68303、3089、56、0808在207bp處有帶，無乳鏈球菌C55934擴(kuò)增陽性，豬鏈球菌C55914擴(kuò)增陽性，見圖1。用引物A1和A2內(nèi)側(cè)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)菌株無乳鏈球菌C55934和分離株2547、2、68303、3089、56、0808有121bp的目的條帶，陰性對(duì)照株豬鏈球菌C55914則沒有，見圖2。

圖1 巢式PCR無乳鏈球菌外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物無乳鏈球菌內(nèi)側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

本試驗(yàn)采用巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均得到預(yù)期相符的207bp的目的片段，通過PCR檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果與生化鑒定結(jié)果的符合率達(dá)100%。

奶牛乳腺炎診斷是奶牛乳腺炎防治的第一重要步驟。傳統(tǒng)的檢測(cè)無乳鏈球菌的方法有理化檢測(cè)法和體細(xì)胞間接檢測(cè)法，但檢測(cè)的對(duì)象只是牛奶中體細(xì)胞及炎性細(xì)胞碎片。其原理是患有乳腺炎的奶牛因乳腺炎癥反應(yīng)，受損的乳腺細(xì)胞和炎性細(xì)胞崩解成碎片。炎癥嚴(yán)重者，則細(xì)胞碎片越多，根據(jù)診斷液與碎片反應(yīng)強(qiáng)弱的程度，可判斷炎癥的等級(jí)。該法雖非常實(shí)用，但不具有特異性，且通過目測(cè)判定等級(jí)，準(zhǔn)確度不很高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，我們采用取奶樣作細(xì)菌分離培養(yǎng)，再結(jié)合生化特征鑒定及血清學(xué)鑒定，將初步鑒定為無乳鏈球菌的菌株；過夜培養(yǎng)后巢式PCR檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果與生化鑒定結(jié)果的符合率達(dá)100%。國(guó)內(nèi)許多地方都分離到了無乳鏈球菌，李宏勝等［7］采集了成都、蘭州、鄭州、濟(jì)南、哈爾濱、南昌6個(gè)城市各種類型乳房炎奶樣280頭份（340個(gè)乳室），經(jīng)細(xì)菌分離鑒定共分得12種316株菌，無乳鏈球菌總的分離率為15．56%。雙金等［8］共檢測(cè)內(nèi)蒙古泌乳牛283頭次1 078個(gè)乳區(qū)，隱性乳房炎的頭陽性率為61．84%，無乳鏈球菌的分離率為20．83%。劉佩紅等［9］對(duì)通過上海32個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)433份奶樣的分離鑒定，共分離出254株細(xì)菌，其中無乳鏈球菌的分離率9．8%。

本試驗(yàn)利用鏈球菌屬（Streptococcus）16S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物作為鏈球菌屬的陽性控制，在保守區(qū)內(nèi)的可變區(qū)設(shè)計(jì)無乳鏈球菌特異的引物。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過奶樣中無乳鏈球菌的增菌培養(yǎng)，簡(jiǎn)便、快速提取DNA和特異性PCR反應(yīng)，可以檢測(cè)到奶樣中的無乳鏈球菌，可以用作牛群中無乳鏈球菌感染的早期流行病學(xué)調(diào)查。

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