張俊珍，范瑞文，白俊明，董常生

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷030801）

皮膚包括表皮、真皮和皮下組織，是機體的保護性器官。皮膚內組織決定毛纖維生長、毛色形成、皮膚性質等功能。羊駝毛纖維柔軟纖細且具有多種顏色，是紡織原料的“軟黃金”，其遺傳資源豐富［1］，是對毛纖維進行生物學特性研究的資源庫或活標本。羊駝皮膚韌性強，也是優(yōu)質的皮革原料。這些特點都是由皮膚中表達的基因決定的，本課題組已構建了羊駝皮膚的cDNA文庫，并進行了大規(guī)模測序（以庫名為 ASCD提交到 NCBI）［2］，為研究羊駝皮膚基因的表達提供了基礎?；虻谋磉_受到轉錄因子的調節(jié)，而其結合位點決定著轉錄的效率。

真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，轉錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉錄起始復合物，共同參與轉錄起始的過程。轉錄因子的 結 合 位 點 （transcription factor binding site，TFBS）是轉錄因子調節(jié)基因表達時，與轉錄因子mRNA結合的區(qū)域，TFBS長度一般為6～12bp范圍內，位于基因非編碼區(qū)，大部分位于5′側翼區(qū)，但有時也位于3′側翼區(qū)或內含子區(qū)。轉錄因子通過特異性結合調控區(qū)域的DNA序列來調控基因轉錄過程。一個轉錄因子往往同時調控若干個基因，而它在不同基因上的結合位點具有一定的保守性，又不完全相同［3］。本文通過對獲得的表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）進行分析，以發(fā)現(xiàn)可能的轉錄因子結合位點，并用實時定量PCR法對表達豐度高的轉錄因子及其結合位點進行不同毛色皮膚中的相對定量檢測，為研究調控羊駝皮膚發(fā)育和毛色生物學的分子機制提供基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 本文所用材料為本室構建的白色青年羊駝皮膚cDNA文庫，該文庫經大規(guī)模測序，并提交到 NCBI的EST序列（庫名為 ASCD）（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／nucest？term＝alpaca ＆dong）。

1．2 方法

1．2．1 序列信息處理 用CAP3軟件（華大基因公司）將EST序列進行裝配，再用BLASTN軟件將裝配好的序列與NCBI nr數(shù)據進行比對，并用GO軟件（華大基因公司）對發(fā)現(xiàn)的已知序列進行注釋和聚類。

1．2．2 對皮膚基因的轉錄因子結合位點進行比較基因組分析 應用oPOSSUM分析軟件（http：／／www．cisreg．ca／cgibin／oPOSSUM／opossum），參照人皮膚中表達的同類已知基因，分析羊駝皮膚可能的轉錄因子結合位點 。脊椎動物轉錄因子結合位點的Fisher score＜0．1時認為是有效的。

1．2．3 高表達的轉錄因子及其結合位點在不同毛色羊駝皮膚中的轉錄表達分析 取液氮保存的羊駝皮膚組織用 Trizol Reagent提取總 RNA，并用Nanodrop測定其濃度。分別取1μg總RNA用SYBR Prime ScriptTMRTPCR KIT（Perfect Real Time）進行反轉錄：10μL反應體系中含5×Prime ScriptTM Buffer 2μL，Prime ScriptTMRTEnzyme Mix10．5μL，Oligo dT Primer25pmol，隨機引物50 pmol，Total RNA 1μL，DEPC水加至10μL。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應條件為37℃15 min，85℃5s。RT產物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

取RT產物，進行實時熒光定量PCR反應：20 μL反應體系中含SYBR Premix ExTaqTM1×，上下游引物各0．2μmol／L（MITF F：5′－AAGTTGCAACGAGAACAGCA－3′，R：5′－CAGTTCTCAAGAGCGGGTTC－3′；CREB1F：5′－GTGTTACGTGGGGGAGAGAA－3′，R：5′－GGGCTAATGTGGCAATCTGT－3′），引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成），ROX Reference DyeⅡ（50×）1×，cDNA模板2μL（約500ng），ddH2O加至20 μL。設置95℃預變性30s后，95℃5s，55℃30s，72℃10s，43個循環(huán)。溫度反應結束，由熔點曲線判定PCR反應的特異性，根據熒光曲線的CT值計算定量結果。內參基因18SrRNA（引物 F：5′－GAAGGGCACCACCAGGAGT－3′，R：5′－GAGACAAATCACTCCACCAA－3′）與目的基因在同一條件下不同管內擴增，每個樣本設3次重復。

2 結果

2．1 羊駝皮膚中發(fā)現(xiàn)的轉錄因子 為了找出調節(jié)皮膚基因表達的可能的轉錄機制，本文選擇530個基因進行分析，結果發(fā)現(xiàn)在羊駝皮膚中有8個轉錄因子，而且大部分為低豐度表達。但MITF的表達量稍高于其他7個轉錄因子（表1）。

表1 羊駝皮膚中表達的轉錄因子

2．2 羊駝皮膚中發(fā)現(xiàn)的轉錄因子結合位點 針對羊駝皮膚中表達的轉錄因子，應用oPOSSUM分析軟件發(fā)現(xiàn)6個不同類型的轉錄因子結合位點。其中，CREB1屬于BZIP類型，與靶基因結合的預測分值最高（表2）。

表2 羊駝皮膚中轉錄因子可能的結合位點

2．3 MITF與CREB1在不同毛色羊駝皮膚中的表達分析 實時定量PCR結果顯示，MITF在棕黑色羊駝皮膚中的表達量顯著高于其在白色羊駝皮膚中的表達量，呈5．938倍數(shù)關系；同時，CREB1在棕黑色羊駝皮膚中的表達量顯著高于其在白色羊駝皮膚中的表達量，呈2．997倍數(shù)關系（見圖1）。

圖1 MITF和CREB1基因在不同毛色羊駝皮膚中的實時熒光定量PCR結果

3 討論和結論

根據轉錄因子的作用特點可分為兩類：第一類為普遍轉錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉錄起始復合物，轉錄才能在正確的位置開始。第二類轉錄因子（Transcription Factor，TF）為組織細胞特異性轉錄因子，這類TF是在特異的組織細胞或是受到一些類固醇激素、生長因子或其他刺激后，開始表達某些特異蛋白質分子時需要的一類轉錄因子。從表1可以看出，羊駝皮膚中存在與皮膚發(fā)育和毛色調控的轉錄調節(jié)因子，關于這些因子有過相關的報道。如熱激基因轉錄因子（heat shock transcription factor family member 5）是調控熱激基因活性的信號傳導鏈中的最終成員［4］。而熱激蛋白是機體處在熱脅迫和大量化學脅迫的環(huán)境中時產生一系列的應激反應，而致體內相關基因的活性迅速增加，并以分子伴侶的形式幫助相關蛋白折疊、穩(wěn)定、組裝、胞內運輸和降解，使機體免受環(huán)境脅迫的影響，在熱境中存活［5］。

Verdoni發(fā)現(xiàn)將角化細胞中的SRF失活可對鼠表皮的發(fā)育起轉錄調節(jié)作用［6］。雖然眾所周知Pax 5可防止淋巴癌，但它在免疫系統(tǒng)外所起的作用也有了相關報道，與其相關的含有成對box的轉錄因子Pax 3在黑色素細胞的發(fā)育過程中起著重要的作用［7］。在羊駝皮膚中，尤其是發(fā)現(xiàn)了組織細胞特異的轉錄因子MITF，MITF是黑色素細胞內黑色素生成相關酶基因的特異的轉錄因子［8－9］，屬bHLH－LZ（basic helix－loop－h(huán)elix－leucine－zipper）的成員［10］，通過識別靶基因啟動子區(qū)的E－box（CAYRTG）、M－box（TCAYRTG or CAYRTGA）［11］和T－box［12］的序列而使靶基因轉錄。黑色素細胞內調節(jié)毛色形成的轉錄因子MITF的結合位點之一，即CREB－1，CREB－1的靶基因預測分值最高，該位點在羊駝黑色素細胞中是一個重要的轉錄因子結合位點［［Mypaper］13］。而 且，相對定量PCR 結果顯示，MITF和CREB1在不同毛色羊駝皮膚中的表達量存在顯著差異。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CREB通過結合cAMP反應元件在黑色素細胞中刺激轉錄，從而在cAMP信號路徑中起調節(jié)作用［14］。在羊駝黑色素細胞中已發(fā)現(xiàn)了 MITF的靶基因 Melanocortin receptor－1（MC1R）、endothelin receptor B （EDNRB）、tyrosinase（TYR）、TYR－related protein 1 （TYRP1）和TYR－related protein 2（DCT）等毛色基因（圖2），這對掌握羊駝皮膚中決定毛色以及其他生理功能的分子機理提供重要的基礎，為后續(xù)研究其他哺乳動物皮膚生物學以及色素形成的調控提供了資源。

圖2 MITF轉錄因子與轉錄結合位點和靶基因間的關系

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