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        傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎中酵母菌的分離和鑒定

        2013-09-23 01:17:42吾爾恩阿合別爾迪楊曉絨木古麗焦子偉
        中國釀造 2013年12期
        關鍵詞:子囊孢子乳糖硝酸鹽

        吾爾恩·阿合別爾迪,楊曉絨,木古麗,焦子偉

        (伊犁師范學院 化學與生物學院,新疆 伊寧 835000)

        博扎(柯爾克孜語勃左)是一種用小米粉自然發(fā)酵而成的發(fā)酵飲料,其制作和保藏工藝天然傳統(tǒng),是一種酒精度低、糖度低、質地濃稠的天然發(fā)酵飲料。博扎的起源可追溯到居住于前奧托曼土耳其的古老民族,作為一種健康飲品延續(xù)至今,不僅在其原產地仍然盛行,而且廣泛傳播至美洲、亞洲等地區(qū),至今只有在我國新疆部分地區(qū)的柯爾克孜族家庭中仍保留著制作和飲用博扎的習慣[1]。

        長期飲用博扎可助消化,治療胃病、高血壓、冠心病等。博扎含酒精很低,既有醪糟的長處,又有啤酒的優(yōu)點。從釀制、用料、加工到酒的形態(tài)都和醪糟都很相似[2]。

        目前含醇飲料的消費趨勢已經向低醇化、營養(yǎng)化及功能化方向發(fā)展,因此應擴大和加強對博扎,尤其是對其微生物成分的研究,可豐富我國益生菌資源庫。有關博扎中微生物成分的報道較少,努爾古麗·熱合曼等[1]報道博扎中有植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lac tobacillus brevis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacerpasteurianus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物成分。因為自然環(huán)境和工藝制作的差異、原料的不同,各地區(qū)博扎中微生物種類可能也不同。從伊寧市三家博扎店采3個樣品,分離和鑒定其中的酵母菌對博扎的研制提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法[3]

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 樣品來源

        采自新疆伊寧市塔爾米為原料的市售博扎,采集后置于4℃冰箱保存。

        1.1.2 培養(yǎng)基[4-13]

        酵母菌富集培養(yǎng)基,馬丁氏培養(yǎng)基,豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基,麥氏培養(yǎng)基,玉米粉瓊脂培養(yǎng)基,葡萄糖(乳糖、蔗糖)發(fā)酵培養(yǎng)基,油脂培養(yǎng)基,明膠液化培養(yǎng)基,硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基,石蕊牛奶培養(yǎng)基,同化碳源基礎培養(yǎng)基,同化氮源基礎培養(yǎng)基等。

        1.2 儀器與設備

        GHP-9050隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海艾牧生物科技有限公司;YXQ-LS-T5SII型立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;GRC-200恒溫振蕩培養(yǎng)箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限責任公司;HC-3018R高速冷凍離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司;FA1004-HANGPING電子天平:上海天平儀器廠;ZHJH-2109C水平流超凈工作臺:上海智城分析儀器制造有限公司;MC-SP21105多功能電磁爐:廣州美的生活電器制造有限公司;揚天T2900D微型計算機:聯(lián)想(北京)有限公司;SFC-288生物顯微鏡:麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 分離純化酵母菌

        首先通過酵母菌富集培養(yǎng)基,于28℃富集培養(yǎng)24h。然后將富集培養(yǎng)后的菌株接入馬丁氏培養(yǎng)基中,培養(yǎng)48h,將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許菌苔接種在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上純化,純化2~3次,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 酵母菌的鑒定

        酵母菌的鑒定程序、方法參考文獻[6,14-15]。

        酵母菌的形態(tài)觀察:

        (1)菌落特征的觀察

        肉眼觀察生長在豆芽汁葡萄糖平板上的酵母菌菌落,根據(jù)菌落大小,菌落顏色,菌落形態(tài)進行描述。

        (2)觀察出芽生殖

        在載玻片上滴1滴蒸餾水,挑取少量酵母放入蒸餾水中,制成臨時裝片,觀察菌體細胞的大小與出芽方式。

        (3)觀察子囊孢子

        ①將酵母接種于豆芽汁培養(yǎng)基中,于28℃~30℃培養(yǎng)24h,然后連續(xù)傳代3~4次,最后轉接到麥氏培養(yǎng)基,在25℃~28℃培養(yǎng)3d左右,使其形成子囊孢子;

        ②從形成子囊孢子的菌落中,取出少量菌體,在載玻片上制作涂片,干燥、固定后,在涂菌處滴5%孔雀綠染液,10min后用水沖洗,再用0.5%番紅染液復染1min;

        ③將涂片置于顯微鏡下,觀察子囊孢子的形狀、特點。(4)假菌絲形成

        新培養(yǎng)物劃線接種于玉米瓊脂培養(yǎng)基上,25℃~28℃培養(yǎng)3d~5d,制成臨時裝片,置于顯微鏡下觀察。

        酵母菌生理生化特征檢測:

        (1)糖類發(fā)酵實驗

        糖類選用葡萄糖、蔗糖、乳糖制備培養(yǎng)基,用1.6%溴甲酚紫溶液將培養(yǎng)基調至紫色,115℃、30min滅菌(滅菌后加10%糖液),接種,置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h,另一支管不接種作為對照,觀察酵母菌對不同糖類的發(fā)酵產酸能力。

        (2)油脂水解實驗

        配制油脂培養(yǎng)基時,預先加入中性紅指示劑或溴甲酚紫指示劑來完成檢驗,將油脂固體培養(yǎng)基融化后,充分振蕩(使油脂分布均勻)傾入無菌空白培養(yǎng)皿,凝固后制成平板,接種,培養(yǎng)48h,觀察培養(yǎng)基中的脂肪是否被分解。

        (3)碳源同化測定

        使用生長譜法測定碳源同化。

        ①制備菌懸液:3mL~5mL無菌生理鹽水倒入斜面,洗下菌苔,4000r/min離心15min,加無菌生理鹽水洗滌,4000r/min離心30min,最后用無菌生理鹽水10mL,制成菌懸液,30℃振蕩培養(yǎng)24h;

        ②制混菌平板:取1mL菌懸液和融化后冷卻至50℃左右的基礎培養(yǎng)基傾注于無菌培養(yǎng)皿中,制成混菌平板,于30℃培養(yǎng)3h。平板底面預先劃區(qū),標記滴加的糖類名稱;

        ③加糖液:取出培養(yǎng)3h的混菌平板,用浸泡過葡萄糖、蔗糖、乳糖的小圓濾紙片,分別放在平板上已劃分好的位置上,30℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,觀察酵母菌對不同碳源的利用情況。

        (4)氮源同化測定

        生長譜法測定氮源同化:①制備菌懸液②制混菌平板③培養(yǎng)基中分別加入0.78%硝酸鉀、0.78%硫酸銨,接種,30℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,觀察酵母菌對不同氮源的利用情況。

        制備明膠培養(yǎng)基,用穿刺法接種酵母菌,置于20℃~22℃恒溫箱內培養(yǎng)4d~5d,觀察培養(yǎng)后的明膠培養(yǎng)基的變化。

        (5)硝酸鹽還原試驗

        將酵母菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中,將3支管置于37℃恒溫箱,培養(yǎng)1d、3d、5d,另外一支管不接種作對照。取干凈的空試管,在試管中倒入少許培養(yǎng)基液,再滴一滴A液及B液,在對照管中同樣加入A、B液各一滴,觀察顏色反應(溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示有亞硝酸鹽存在,為硝酸鹽還原陽性)。

        (6)明膠液化試驗

        利用明膠作為凝固劑的培養(yǎng)基,用穿刺法接種酵母菌,置于20℃~22℃恒溫箱內培養(yǎng)4d~5d,觀察培養(yǎng)后的明膠培養(yǎng)基的變化。

        (7)牛奶胨化試驗

        ①配制牛奶石蕊培養(yǎng)基:脫脂牛奶粉100g,石蕊0.075g,蒸餾水1000mL,混合后的顏色呈丁香花紫色為適度,pH6.8,121℃滅菌15min。

        ②分裝試管,接種,置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)7d,另外保留一支不接種的石蕊牛奶培養(yǎng)基作為對照。

        2 結果與分析

        2.1 酵母菌的個體形態(tài)學特征觀察結果

        將自然發(fā)酵飲料博扎的10-4、10-5和10-63個濃度的稀釋液經富集培養(yǎng)后,在馬丁氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,再在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,純化2次,觀察菌落特征,借助顯微鏡來觀察酵母菌的出芽生殖及假菌絲,再對其進行接代培養(yǎng),結合顯微鏡觀察子囊孢子,結果見表1。

        表1 菌落形態(tài)和細胞形態(tài)結果Table 1 Results of colony shape and cellular morphology

        酵母菌的個體形態(tài)大小、出芽方式、能否產生假菌絲以及子囊孢子形成能力,是酵母菌鑒定的重要依據(jù)。結果顯示,酵母菌大多呈圓形、卵圓形、橢圓形,長約5.4μm,Y4、Y6、Y9、Y10均產生了菌絲,Y3、Y5、Y11均能產生卵圓形子囊孢子,Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12未能觀察到子囊孢子的形成。

        2.2 酵母菌的生理生化特征測定結果

        2.2.1 酵母菌的糖發(fā)酵結果

        分別選取葡萄糖、蔗糖、乳糖進行糖發(fā)酵實驗,結果見表2。

        表2 酵母菌的糖發(fā)酵結果Table 2 Results of yeast sugar fermentation test

        從表2可以看出,菌株Y3、Y5、Y11發(fā)酵能力較好,Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12僅對葡萄糖有發(fā)酵能力。

        2.2.2 油脂水解的測定結果

        在配制油脂培養(yǎng)時,預先加入中性紅指示劑來完成產生脂肪酸的檢驗。經接種培養(yǎng)24h后,觀察平板底層長菌處。結果有平板底層長菌處有紅色斑點出現(xiàn),則表示酵母菌產生了脂肪酶,將培養(yǎng)基中的脂肪分解為甘油及脂肪酸,此為正反應。說明所有酵母菌菌株具有分解脂肪的能力。

        2.2.3 同化能力的測定結果

        各株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力差異明顯,結果見表3。

        由表3可以看出,12株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力有差異,菌株Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12碳源同化葡萄糖、蔗糖,不同化乳糖,Y5、Y11碳源同化能力較弱,同化葡萄糖,不同化蔗糖、乳糖。菌株Y3、Y5、Y4、Y6、Y9、Y10、Y11氮源同化硫酸銨,不同化硝酸鉀,Y1、Y2、Y7、Y8、Y12氮源同化能力較強。

        表3 酵母菌的碳源、氮源同化結果Table 3 Assimilation results of yeast carbon and nitrogen source test

        2.2.4 硝酸鹽還原試驗測定結果

        硝酸鹽還原是指能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,培養(yǎng)基中加入格里斯試劑時,溶液呈現(xiàn)粉紅色、棕色、橙色、玫瑰色等。對12株菌株進行硝酸鹽還原測定,菌株Y1、Y2、Y7、Y8、Y12培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)玫瑰紅色,菌株Y3、Y5、Y11培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)橙色,菌株Y4、Y6、Y9、Y10培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)棕色。結果顯示均有亞硝酸鹽存在,為硝酸鹽還原陽性。

        2.2.5 明膠液化試驗的測定結果

        明膠培養(yǎng)基經酵母菌利用后,均由原來的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài),說明酵母菌具有分解明膠的能力,能向外分泌蛋白酶,分解明膠而產生小分子物質。

        2.2.6 牛奶胨化實驗測定結果

        酵母菌對牛奶的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑,石蕊中性時呈淡紫色,酸性時呈紅色,堿性時呈藍色,還原時則部分或全部脫色。對12株菌株進行牛奶胨化培養(yǎng),均呈現(xiàn)橙紅色,說明酵母菌發(fā)酵乳糖后產酸,使石蕊牛乳變紅。酵母菌具有發(fā)酵乳糖產酸能力。

        3 結論

        試驗結果表明,Y1、Y2、Y7、Y8、Y12菌株細胞圓形或卵圓形,為兩段芽殖,無子囊孢子;其發(fā)酵葡萄糖,不發(fā)酵蔗糖、乳糖;碳源同化葡萄糖、蔗糖,不同化乳糖;氮源同化硝酸鉀和硫酸銨;牛奶反應陽性;明膠液化陽性;硝酸鹽還原陽性。綜合該菌以上特征,根據(jù)《The Yeast,A Taxonomic Study》[8]初步鑒定為真菌門半知菌亞門,芽孢菌綱隱球酵母目,隱球酵母科隱球酵母屬(Cryptococcus)。

        Y4、Y6、Y9、Y10菌株細胞卵圓形或圓形,兩端芽殖,液具環(huán),無子囊孢子;玉米粉培養(yǎng)基載玻片培養(yǎng)時,可見大量的假菌絲;發(fā)酵葡萄糖、蔗糖,不發(fā)酵乳糖;碳源同化葡萄糖、蔗糖,不同化乳糖;氮源同化硫酸銨,不同化硝酸鉀;牛奶反應陽性;油脂分解;明膠液化陽性。綜合該菌以上特征,根據(jù)D亞羅《酵母菌的特征與鑒定手冊》[6]初步鑒定為真菌門半知菌亞門,芽孢菌綱隱球酵母目,隱球酵母科假絲酵母屬(Candida)。

        Y3、Y5、Y11菌株細胞圓形或卵圓形,周邊芽殖,有1~4個子囊孢子;發(fā)酵葡萄糖、蔗糖,不發(fā)酵乳糖;碳源同化葡萄糖、蔗糖,不同化乳糖;氮源同化硫酸銨,不同化硝酸鉀;牛奶反應陽性;明膠液化陽性;油脂分解。綜合該菌以上特征,根據(jù)J.A.尼巴特《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]初步鑒定為真菌門子囊菌亞門,子囊菌綱內孢霉目,內孢霉科釀酒酵母屬(Scerevisiae)。

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