何衛(wèi)新，康立超，楊 華，田 亮，黃 新，韓猛立

（1．新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆 石河子832000；2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團農(nóng)十二師一〇四團牧三場，新疆 烏魯木齊830009）

2011年本場羔羊突然發(fā)病，發(fā)病率在5%左右，死亡率可達20%。因為該場原先暴發(fā)過牦牛多殺性巴氏桿菌病［1－2］，導(dǎo)致大批牦牛發(fā)病死亡。懷疑此次羔羊發(fā)病可能也與該菌有關(guān)，比較嚴重。隨即，將瀕死羔羊送往新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所診斷鑒定，剖檢肺臟出現(xiàn)肉變和肝變，有化膿結(jié)節(jié)，其他臟器無明顯變化。通過藥敏試驗指導(dǎo)用藥，有效控制病情。進一步分析報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 瀕死哈薩克羔羊2只，剖檢取心血、肺臟、肝臟等。

主要試劑和儀器TaqDNA聚合酶和dNTP，購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；支原體肉湯培養(yǎng)基和支原體瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。PCR儀和凝膠成像分析儀為BIO．RAD。

1．2 方法

1．2．1 細菌分離純化 病料無菌操作接種于綿羊鮮血平板、巧克力平板和改良LB肉湯［3］，37℃培養(yǎng)24～36h，三線四區(qū)分離純化，鏡檢。在鮮血平板上生長的菌落形態(tài)一致，染色結(jié)果相同的暫歸為同一種菌；在同一個平板上同一病料初次接種生長的同一種菌，菌苔和菌落數(shù)量明顯較多的歸為優(yōu)勢菌株。

1．2．2 支原體分離培養(yǎng) 無菌操作將病料勻漿，1倍稀釋，離心后過0．45μm的濾器，濾液接種于支原體肉湯培養(yǎng)基和支原體瓊脂培養(yǎng)基上10%CO237℃培養(yǎng)72h，觀察肉湯變色和菌落形態(tài)。

1．2．3 PCR鑒定分析 分離純化病原菌堿裂解法提取細菌基因組，參考細菌16SRNA通用引物F27：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R1492：TACGGYTACCTTGTTACGACTT擴增片段［4］，測序比對確定病原菌種屬。擴增體系：10×Buffer 2．5 μL，dNTP（2．5mmol／L）2μL，F(xiàn)27（10μmol／L）1μL，R1492（10μmol／L）1μL，模板 DNA1μL，Taq酶0．3μL，加水補足25μL ；反應(yīng)程序：94℃4min；94℃30s，56℃45s，72℃1．5min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠在1×TBE電泳液中電泳30min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。條帶明亮清晰樣的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。所得序列結(jié)果提交GenBank，BLAST對序列進行同源性比對鑒定，用MEGA 5．0軟件進行聚類分析。

1．2．4 致病性試驗 分離純化優(yōu)勢病原菌LB肉湯培養(yǎng)24h，每5只小鼠1組腹腔注射0．2mL，對照組5只注射LB肉湯，觀察小鼠死亡情況。

1．2．5 藥敏試驗 將各病料無菌碾磨，均勻涂布于綿羊鮮血平板上，再分別貼上藥敏紙片37℃培養(yǎng)24 h。觀察對常用25種常用獸藥（阿奇霉素、頭孢噻肟鈉、氨芐西林鈉、達力新（頭孢呋辛鈉）、頭孢哌酮鈉、頭孢拉定、混感金剛（阿奇＋氟苯尼考）、超能鏈殺（硫酸慶大小諾霉素）、勝?。蛩嵴尘兀?、速喘寧（泰樂菌素＋磺胺）、宇生連枝監(jiān)劍（泰樂菌素）、奇效痢停（慶大＋利福平）、林克霉素、混干百益（林可霉素）、痢拉克（環(huán)丙沙星）、卡那霉素、長效菌毒精品（普魯卡因青霉素）、惡痢絕（氧氟沙星）、混感全能（氟苯尼考）、恩諾沙星、鏈磺速治（復(fù)合磺胺）、鏈霉素、青霉素G、重瀉速克（痢菌凈）和克林霉素）的敏感性（藥敏紙片藥品含量與判定標準參考杭州天和微生物試劑有限公司）。

2 結(jié)果

2．1 分離培養(yǎng) 從肺臟、肝臟分離到大量病原菌。革蘭陽性球菌，溶血；革蘭陰性小桿菌，不溶血。第1只羔羊病料培養(yǎng)情況，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和溶血情況分離得到3株病原菌：XJ104－YF－1、XJ104－YF－2和XJ104－YF－3；第2只分離得到4株：XJ104－YF－4、XJ104－YF－5、XJ104－YF－6和 XJ104－YF－7。支原體培養(yǎng)結(jié)果陰性。

2．2 鑒定 PCR結(jié)果在預(yù)計1 500bp處擴增出單一明亮的目的片段（圖 1）。序列比對（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／），結(jié)果7株菌為3種菌（圖2）。兩只羔羊肺炎病原都分離到化膿隱秘桿菌（Arcanobacteriumpyogenes）和鏈球菌（Streptococcus），另1只還分離到不動桿菌（Acinetobacter），各菌株16SrDNA序列提交GenBank登錄號見表1?；撾[秘桿菌和不動桿菌與NCBI上已登錄的序列同源性達到100%，鏈球菌達到99%，均屬于同一種菌［6］。

圖1 16SrDNA PCR擴增

圖2 羔羊肺炎病原菌16SrDNA序列聚類分析

表1 病原菌種屬和登錄號

2．3 致病性 化膿隱秘桿菌和鏈球菌具有較強的致病性，能在24h內(nèi)使5只小鼠全部死亡，剖檢死亡小鼠，從心血和肝臟中均能分離培養(yǎng)出初攻毒菌株；不動桿菌致病性不強，小鼠精神委靡后，恢復(fù)正常。對照組小鼠健活。

2．4 藥敏 為了及時指導(dǎo)臨床用藥，控制病情。本試驗直接將病料涂布于鮮血平板上做藥敏試驗。結(jié)果初次分離到病原菌僅對阿奇霉素、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢哌酮鈉、頭孢拉定、混感金剛、奇效痢停、氧氟沙星和氟苯尼考等有敏感性，其余大多中敏，很少有耐藥。

3 討論

16SrRNA序列分析是細菌系統(tǒng)分類研究中最常用的工具之一，其結(jié)構(gòu)和功能高度保守。一般認為，16SrRNA序列同源性小于97%，可以認為屬于不同的種，同源性小于93%～95%，可以認為屬于不同的菌［6］。

本試驗通過分離培養(yǎng)和PCR測序以及致病性試驗，了解了此次羔羊肺炎發(fā)病的病原菌為化膿隱秘桿菌和鏈球菌，并非是多殺性巴氏桿菌。分離得到不動桿菌有可能是羔羊在發(fā)病后期，抵抗力差，環(huán)境中細菌通過呼吸道感染肺臟。綿羊傳染性胸膜肺炎病原－支原體未能分離到，表明該羊場未受到支原體感染的威脅，否則病情會更加嚴重。

此次發(fā)病地點屬高山牧場，以放牧為主。相對規(guī)?；B(yǎng)殖，抗生素的使用較少。因此藥敏試驗結(jié)果顯示敏感藥物較多，也為臨床治療提供了理論依據(jù)。

哈薩克羊是新疆當?shù)赝练N羊，具有很強的抗寒和抗病能力?；撾[秘桿菌和鏈球菌都是機會致病菌?；撾[秘桿菌和鏈球菌混合感染羔羊先前未見報道，這次能夠引起哈薩克羔羊發(fā)病，說明兩種菌混合感染具有很強的致病性。杜昕波報道也從斑羚和巖羊肺炎中分離到化膿隱秘桿菌［6］。通過本試驗的完成，為更有效治療和預(yù)防羔羊肺炎，以及疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

［1］ 康立超，田亮，張曉宇，等．新疆牦牛多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥物敏感實驗［J］．石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，28（4）：436－440．

［2］ 康立超，鐘發(fā)剛，王平福，等．牦牛巴氏桿菌和葡萄球菌的分離鑒定［J］．中國獸醫(yī)雜志，2008，44（10）：70－71．

［3］ 李建強，李六金．獸醫(yī)微生物學(xué)實驗實習指導(dǎo)［M］．西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1999：156－181．

［4］ Lane D J．16S／23SrRNA sequencing，In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics［M］．Edited by E Stackebrandt＆ M GoodfellowNewYork：Wiley，1991：115－175．

［5］ Stackebrandt E，Goebel B M．Taxonomic note：aplace for DNA－RNA reassociation and 16SrRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology［J］．Int J Syst Bacteriol，1994，44：842－849．

［6］ 杜昕波，趙耘．3株斑羚、巖羊化膿隱秘桿菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：60－62．