謝 晶，廖黨金，汪 明，何萬(wàn)平，曹 冶，趙素君，曾 偉，李江凌，潘保良，葉勇剛，羅丹丹

（1．四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都610066；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；3．四川省洪雅縣畜牧獸醫(yī)局，四川 洪雅620300；4．四川陽(yáng)平種牛公司，四川 洪雅620300）

奶牛腐蹄病是奶牛場(chǎng)最常見(jiàn)的疫病之一，在我國(guó)各地都表現(xiàn)出較高的發(fā)病率，尤其是在我國(guó)南方，其高溫、高濕、集約化飼養(yǎng)等自然條件，奶牛場(chǎng)的腐蹄病更為嚴(yán)重。腐蹄病的發(fā)生引起奶牛產(chǎn)奶量下降，繁殖率，飼料報(bào)酬降低，治療成本增加，嚴(yán)重者常常導(dǎo)致奶牛過(guò)早淘汰，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，舍飼牛群中發(fā)病率高者可達(dá)到30%～40%，目前我國(guó)每年因腐蹄病被迫淘汰的奶牛占淘汰總數(shù)的15%～30%，給奶牛業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2 250萬(wàn)元［1］。關(guān)于牛腐蹄病的病原，一直存在著爭(zhēng)議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為牛和綿羊感染性蹄病的主要病原體是壞死梭桿菌和節(jié)瘤擬桿菌，該病的發(fā)生主要是由壞死梭桿菌和節(jié)瘤擬桿菌共同感染而引起的，節(jié)瘤擬桿菌感染動(dòng)物的蹄部之后，將其蹄部皮膚和基層的完整性破壞，為壞死梭桿菌對(duì)蹄部的侵入和感染創(chuàng)造了有利的條件，壞死梭桿菌感染表面損傷的蹄部后引起蹄部組織的化膿、壞死以及全身的病理變化。在腐蹄病病原中，除主要病原壞死梭桿菌和節(jié)瘤擬桿菌外，還有產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌，脆弱擬桿菌以及其他化膿壞死微生物區(qū)系，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和化膿棒桿菌等并發(fā)感染。此外，螺旋體、糞彎桿菌、變形桿菌、球菌、酵母、微球菌［2－5］。

四川省奶牛養(yǎng)殖主要分布在成都、洪雅、南充、眉山、雅安、巴中、達(dá)州、西昌等大中城市郊區(qū)，養(yǎng)殖數(shù)量占全省養(yǎng)殖數(shù)量的80%左右。其中成都、洪雅、眉山等地地處四川盆地，屬于亞熱帶濕潤(rùn)氣候，氣候溫和，雨量豐沛，5～9月份為降雨集中時(shí)段，降雨量占年總降雨量的85%左右，也是奶牛腐蹄病高發(fā)季節(jié)。在這種高溫高濕地區(qū)奶牛因患蹄病淘汰率高達(dá)31．8%，在管理較好的奶牛場(chǎng)，淘汰奶牛中因腐蹄病淘汰的奶牛約占15%。腐蹄病是四川奶牛養(yǎng)殖中常見(jiàn)疾病，是影響奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量主要原因之一，在規(guī)模化牛場(chǎng)主要采用硫酸銅浴蹄和抗生素治療［6－7］。由于不清楚感染性蹄病的主要致病菌類型和分布，在抗生素應(yīng)用上存在很大盲目性，造成用藥成本高并存在藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)展奶牛腐蹄病病原調(diào)查和藥物敏感試驗(yàn)研究為該地區(qū)奶牛腐蹄病的科學(xué)、有效的防治及奶牛養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料 牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，瓊脂粉，氯化血紅素，半胱氨酸等化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。清潔型小鼠購(gòu)自華西醫(yī)大。藥敏片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1．2 臨床樣本采集 在洪雅、金堂、眉山、邛崍等8個(gè)規(guī)模在200頭以上的奶牛場(chǎng)進(jìn)行奶牛腐蹄病樣本的采集。患蹄先經(jīng)駐場(chǎng)獸醫(yī)修剪后，用無(wú)菌生理鹽水沖洗，用無(wú)菌活性炭棉拭子抹取患病部位，或無(wú)菌剪開(kāi)化膿部位，用無(wú)菌活性炭棉拭子抹取深部膿汁，每個(gè)樣本采集3個(gè)棉拭子，一個(gè)立即放入已經(jīng)還原的心腦浸液液體培養(yǎng)基試管，將試管放入玻璃干燥器內(nèi)，厭氧處理后用凡士林密封干燥器，送回實(shí)驗(yàn)室；第2個(gè)棉拭子放入滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，送回實(shí)驗(yàn)室；用第3個(gè)棉拭子將病料涂于載玻片上，干燥經(jīng)火焰固定后帶回實(shí)驗(yàn)室用革蘭染色法染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1．3 細(xì)菌的分離 將已經(jīng)采集樣本的干燥器和肉湯培養(yǎng)基于37℃進(jìn)行厭氧和需氧培養(yǎng)48～96h，沾取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到心腦浸液固體培養(yǎng)基、卵黃培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，分別進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，分離單個(gè)菌落，根據(jù)細(xì)菌在不同培養(yǎng)基的菌落形態(tài)進(jìn)行分類，對(duì)同一類型的單菌落挑取2～3個(gè)進(jìn)行革蘭染色鏡檢，再將染色特性相似的歸類，并將單個(gè)菌落在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，制成20%甘油菌液于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離的厭氧菌單個(gè)菌落接種于心腦浸液培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧純培養(yǎng)，需氧菌單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行需氧純培養(yǎng)，勾取純培養(yǎng)物接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，接種小鼠5只，每只腹腔注射0．2mL，觀察分離細(xì)菌對(duì)小鼠的致病性。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，無(wú)菌采集肝臟、心血進(jìn)行細(xì)菌的再分離培養(yǎng)，獲得的單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并制備甘油菌于－20℃和液氮保存。另外，單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1．5 致病細(xì)菌鑒定 將對(duì)小鼠致病的細(xì)菌復(fù)壯，純培養(yǎng)物采用美國(guó)Biolog公司的Microstation儀器進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1．6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取分離病原菌純培養(yǎng)，單菌轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，吸取一定量過(guò)夜培養(yǎng)菌液涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將臨床常用抗生素藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，置37℃培養(yǎng)箱厭氧或需氧培養(yǎng)12～24h后，觀察并測(cè)定抑菌情況。

2 結(jié)果

2．1 致病細(xì)菌的分離和鑒定 棉拭子病料涂片革蘭染色鏡檢，均可觀察到不同細(xì)菌形態(tài)。共分離到細(xì)菌45株，經(jīng)過(guò)小鼠致病性試驗(yàn)，獲得致病性細(xì)菌20株，生化鑒定為大腸桿菌（11／20），壞死梭桿菌（4／20），普通變形桿菌（1／20），奇異變形桿菌（2／20）和一種梭狀芽孢桿菌（2／20）。其中，壞死梭桿菌致死小鼠注射部位形成干酪樣膿腫。各致病菌菌落形態(tài)以及鏡檢形態(tài)見(jiàn)表1。

表1 致病菌生長(zhǎng)特性及形態(tài)特征

2．2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，奇異變形桿菌和普通變形桿菌對(duì)抗生素的敏感性類似，大腸桿菌分離株對(duì)抗生素的敏感性有所不同，壞死梭桿菌對(duì)林可霉素和潔霉素最敏感。

表2 致病菌藥敏試驗(yàn)

3 討論

因?yàn)槟膛ｐB(yǎng)殖地區(qū)、環(huán)境的不同，養(yǎng)殖衛(wèi)生的不同，奶牛腐蹄病感染的病原微生物區(qū)系比較復(fù)雜。本試驗(yàn)對(duì)四川主要奶牛養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行了奶牛腐蹄病病原的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛腐蹄病病原有大腸桿菌、壞死梭桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌和梭狀芽孢桿菌。大腸桿菌和變形桿菌屬是人和動(dòng)物腸道的正常寄居菌，廣泛存在于泥土、水和糞污中，是人和動(dòng)物感染的重要條件致病菌，且其感染具有持久性和難治性，因此，養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生條件控制至關(guān)重要。在分離病原菌時(shí)，由于采集的病料的方法和分離的不同，可能會(huì)造成一些條件致病菌在分離過(guò)程中丟失。另外，由于采樣的患病奶牛多已經(jīng)進(jìn)行過(guò)抗生素治療，在病料涂片鏡檢時(shí)8個(gè)奶牛場(chǎng)均觀察到典型的呈串珠狀或細(xì)長(zhǎng)桿狀的壞死梭桿菌，但是在病原菌分離過(guò)程中卻只有很少機(jī)會(huì)分離到其單個(gè)菌落。本次分離到的梭桿菌屬芽孢桿菌在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步深入研究。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，分離的引起四川奶牛腐蹄病的病原菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物具有較好的敏感性，在臨床上多選用敏感、藥殘較低的藥物結(jié)合綜合防制措施進(jìn)行治療。

［1］ 鄒靜．西昌市奶牛腐蹄病的診治［J］．畜禽業(yè)，2010，258：82－84．

［2］ 蘇曉健，趙永旺，徐小琴，等．牛腐蹄病病原微生物的分離鑒定［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2009，11：92－93．

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［7］ 廖黨金，汪明，謝晶，等．四川省荷斯坦奶牛疾病調(diào)查分析［J］．中國(guó)奶牛，2010，（2）：35－36．