王 芳，張彥昌

（河北省邯鄲市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 邯鄲056005）

牛結(jié)核病是由牛分支桿菌和結(jié)核分支桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，嚴(yán)重威脅人類生命健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。目前一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)消滅和控制了牛結(jié)核病。而更多國家，尤其是第三世界國家，牛結(jié)核病還在廣泛流行。

凈化牛結(jié)核病的主要手段之一是檢測后淘汰陽性牛。目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的牛結(jié)核病的檢測診斷方法仍是結(jié)核菌素（PPD）變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。另外一種是近年來國際上畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家剛剛流行的血清學(xué)診斷試驗(yàn)－IEN－γ干擾素方法。本文是結(jié)合臨床病例就兩種檢測方法的相關(guān)性、實(shí)用性等做比較，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 牛結(jié)核菌素購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，批號(hào)為201001。牛結(jié)核分支桿菌γ－干擾素檢測試劑為中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室提供的進(jìn)口分裝γ－干擾素檢測試劑，失效期是2011年11月9日。

1．1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 某奶牛場存欄奶牛。該牛場存欄奶牛約70頭，產(chǎn)奶量普遍不高，奶牛漸進(jìn)性消瘦。在2011年9月秋季例行結(jié)核病檢測中發(fā)現(xiàn)過牛結(jié)核病陽性牛。選取16頭消瘦較嚴(yán)重奶牛編號(hào)（1～16號(hào)）。

1．2 方法

1．2．1 牛分支桿菌結(jié)核菌素（PPD）變態(tài)反應(yīng)和γ－干擾素平行對(duì)比試驗(yàn)檢測16頭奶牛。

1．2．2 牛分支桿菌結(jié)核菌素（PPD）變態(tài)反應(yīng) 按《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB／T18645－2002）》中結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行。無論大小牛只，一律皮內(nèi)注射0．1mL（含2 000IU）牛型結(jié)核分支桿菌PPD，72h仔細(xì)觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測量皮皺厚度。皮厚差小于2．0mm以下的為陰性牛，皮厚差大于或等于4．0mm的為陽性牛，皮厚差大于或等于2．0mm、小于4．0mm為疑似牛。

1．2．3 牛結(jié)核分支桿菌γ－干擾素檢測試驗(yàn)，按《牛結(jié)核分支桿菌γ－干擾素檢測操作規(guī)程》進(jìn)行。第一階段：全血培養(yǎng)，用肝素真空采血管采集16頭奶牛血液。室溫25℃6h后，加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭牛加三管1．5mL分裝的抗凝血，三管分別加入刺激抗原（PBS，禽PPD，牛PPD），37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育18h，收集上層血漿每孔400μL。第二階段：牛γ－干擾素酶免疫試驗(yàn)；4h后，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm數(shù)值。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2．1 變態(tài)反應(yīng) 注射牛結(jié)核菌素后第3天發(fā)現(xiàn)16頭牛中1頭牛皮厚差3．90mm，接近4．0mm，判定為疑似陽性；另1頭牛皮厚差小于2．0mm，判定為陰性牛；其余14頭奶牛的注射部位炎性明顯，皮厚差大于4．0mm。初步判定為陽性牛。

變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)束后第2天，我們對(duì)16頭奶牛進(jìn)行了牛結(jié)核分支桿菌γ－干擾素檢測。

2．2 牛結(jié)核分支桿菌γ－干擾素 本次試驗(yàn)牛γ－干擾素陰性對(duì)照平均OD值是0．0556，陰性對(duì)照＜0．130；陽性平均 OD值對(duì)照2．119，陽性對(duì)照＞0．700。同時(shí)各陰性對(duì)照重復(fù)孔差值不大于0．040，陽性對(duì)照重復(fù)孔OD值變化幅度不超過其平均OD值的30%。試驗(yàn)成立。

所有樣本陰性抗原OD值0．0696，禽PPD抗原OD值0．189，牛PPD抗原 OD值1．02。

15頭牛γ－干擾素檢測結(jié)果和變態(tài)反應(yīng)結(jié)果一致，只有2號(hào)牛出現(xiàn)兩種檢測方法不一樣的情況。

2．3 兩種檢測方法具體數(shù)值

2．4 2號(hào)牛γ－干擾素呈現(xiàn)陰性，而變態(tài)反應(yīng)是弱陽性；9號(hào)牛兩種檢測方法均出現(xiàn)弱陽性，可以判定為疑似陽性。60d后我們對(duì)這兩頭牛再次進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，其中2號(hào)牛72h皮厚差小于2．0mm，判定為陰性牛。9號(hào)牛皮厚差3．85mm，60d后再做變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，皮厚差為4．80mm，判定為陽性牛。

3 結(jié)果分析與比較

3．1 以上結(jié)果表明，用γ－干擾素的檢測方法進(jìn)行平行對(duì)比試驗(yàn)，其中15頭牛的檢測結(jié)果和結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)結(jié)果是一致的，相關(guān)率為93．75%。

3．2 2號(hào)牛兩種檢測方法出現(xiàn)不同結(jié)果，應(yīng)是測量皮厚差時(shí)牛的保定情況和人員主觀操作影響測量的準(zhǔn)確度，存在誤差。

表1 檢測試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3．3 變態(tài)反應(yīng)成本低，操作簡單，檢出率高。但試驗(yàn)過程耗時(shí)較長，操作、解釋上存在主觀性。γ－干擾素檢出率高，耗時(shí)比變態(tài)反應(yīng)縮短，易于用作牛群大量樣品的測試，沒有抗原浸入。但它的試劑價(jià)格昂貴，成本高，國內(nèi)目前沒有適量規(guī)格的試劑盒出售；藥物特別是地塞米松類藥物的應(yīng)用可干擾γ－干擾素的檢測，采血后8h內(nèi)必須進(jìn)行檢測，過程嚴(yán)格，對(duì)操作者要求高?；谝陨显?，γ－干擾素檢測牛結(jié)核病的推廣目前還存在一定難度。尤其是基層疫控機(jī)構(gòu)，用變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測牛結(jié)核病比較實(shí)際。