王光華，葉成玉，蔡其剛，王戈平，陸 艷，張芳芳，馬利青，周繼章

（1．青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，甘肅 蘭州730046）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV），也稱牛病毒性腹瀉－黏膜病病毒，與豬瘟病毒（CSFV）、羊邊界病毒（BDV）同屬黃病毒科，瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，整個基因組大小約為12．5kb，包含有一個大的開放閱讀框和兩側(cè)的非編碼區(qū)［1］。開放閱讀框編碼一個近4 000個氨基酸的多聚蛋白（E2的克隆與序列分析），從N端到C端的順序為：Npro（P20）、EC（P14）、E0（gP48）、E1（gP25）、E2（gP53）、P7、NS2－3（P125）、NS4A（P10）、NS4B（P32）、NS5A（P58）、NS5B（P75），其中EC、E0、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白，其他的為非結(jié)構(gòu)蛋白［2］。其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白主要位于BVDV基因組5′－N端部分。其中E0、E1和E2是糖基化蛋白。而E0、E2為保護性抗原基因，其蛋白具有抗原性，免疫原性以E2最強，但E2是BVDV結(jié)構(gòu)蛋白中變異率較高的一種蛋白，抗原逃逸及突變頻率較高，是導(dǎo)致疫苗保護失效和牛持續(xù)性感染的主要原因［3］。E0是BVDV編碼蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和HCV的能力［4］，因此它可用于研究基因工程亞單位疫苗及基因工程診斷抗原，防治牛病毒性腹瀉。本試驗中克隆和表達了BVDV青海牦牛QHZK株的E0基因，為進一步研究BVDV E0蛋白的生物學(xué)活性，制備基因工程診斷抗原奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、IPTG、ExTaq酶、pMD18－T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；低分子量蛋白質(zhì) Marker，DL－2 000DNA Marker，T4DNA連接酶，氨芐青霉素，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗牛IgG，購自Sigma公司。

1．2 質(zhì)粒與菌種 pMD18－T－E0質(zhì)粒，由本實驗室構(gòu)建并保存；DH5α菌株，購自寶生物工程（大連）有限公司，Rosetta菌株，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，原核表達載體pET－32a由本實驗室保存。

1．3 E0基因的原核表達及抗原性檢測

1．3．1 E0基因的擴增 引物序列為：PF1 5′－CCCGAATTCATGGAGAACATAACACA－3′，PF2 5′－CCCCTCGAGTTATGCATATGCCCC－3′。反應(yīng)條件及體系：按照RT－PCR試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系（25 μL）：10×RT－PCR Buffer 2．5μL，dNTP mixture（2．5 mmol／L）4．0μL，RNase inhibitor（40U／μL）1．0μL，上下游引物（0．1μmol／L）各1μL，AMV reverse transcriptase（5U／μL）0．5μL，Taqpolymerase（5U／μL）0．5μL，總 RNA （1μg／μL）2．0μL，DEPC水12．5 μL。PCR反應(yīng)條件：45℃30min；95℃3min；94℃30 s，58℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物以5V／CM恒定電壓于10 g／L瓊脂糖凝膠中電泳。

1．3．2 E0基因的純化及克隆 用膠回收試劑盒純化BVDV QHZK株E0基因PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物與pMD18－T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α菌株，經(jīng)氨芐青霉素、X－gal篩選，挑取白色菌落接種于5mL含氨芐青霉素（終濃度50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h之后提取質(zhì)粒。

1．3．3 重組質(zhì)粒 pET－32α－E0的構(gòu)建 將pET－32a原核表達載體和pMD18－T－E0克隆質(zhì)粒分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，用膠回收試劑盒回收具有黏性末端的E0基因和pET－32α原核表達載體，在T4DNA連接酶作用下16℃連接5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。

1．3．4 重組質(zhì)粒的鑒定 將5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Rosetta（DE3）中，經(jīng)IPTG／X－gal瓊脂平板藍白菌落篩選，隨機挑選白色菌落用含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及PCR鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET－32α－E0。

1．3．5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達、蛋白純化與抗原性檢測 取50μL陽性克隆菌液加入到5mL含50μg／mL氨芐青霉素（50μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶50增菌于含氨芐青霉素（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至吸光度OD600為0．6～1．0之間，取出1mL未誘導(dǎo)菌液做陰性對照，4℃保存。余者加入IPTG至終濃度1mmol／L，200r／min，37℃誘導(dǎo)表達4h收集菌液，取1mL于1．5mL的離心管中，6 000r／min離心3min，棄上清，收集菌體。用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測表達產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2．1 E0基因的原核表達

2．1．1 E0基因的 RT－PCR擴增 將 RT－PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在700bp左右處有一特異性擴增條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，如圖1。

圖1 E0基因RT－PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

2．1．2 重組質(zhì)粒pET－32α－E0的鑒定 重組質(zhì)粒pET－32α－E0經(jīng)PCR以及EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切得到約700bp目的基因片段，與預(yù)期的結(jié)果一致（如圖2），證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET－32α－E0的PCR和酶切鑒定

2．1．3 E0基因表達產(chǎn)物的檢測 重組質(zhì)粒pET－32α－E0轉(zhuǎn)化入Rosetta感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h，將不同時間段收集的誘導(dǎo)菌液變性處理后進行SDS－PAGE分析（圖3）。在約44kDa分子量標(biāo)記處，出現(xiàn)明顯的電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的蛋白獲得表達。

圖3 E0基因表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

4 討論

牦牛作為青藏高原上的稀有牛種，主要生長在我國2 500m至5 000m的高山草原上。自1983年［5］，李佑民等在我國首次分離并鑒定出BVDV以來，該病在我國牛群中流行較廣，造成了極大的危害，但國內(nèi)學(xué)者對于牦牛BVDV分子生物學(xué)方面的報道較少，因此，開展牦牛BVDV的分子生物學(xué)研究意義重大。本研究對青海牦牛BVDV毒株的E0蛋白進行了生物信息學(xué)分析，采用生物學(xué)軟件對E0蛋白的抗原指數(shù)、親水性及B細胞抗原表位進行了分析。結(jié)果表明，E0蛋白氨基酸的親水性與抗原性指數(shù)呈平行相關(guān)性，QHZK株E0蛋白氨基酸的親水性與抗原性指數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)毒株VEDEVAC、C24V非常相似，從而證明E0基因在BVDV各毒株間具有一定保守性，有利于研究亞單位疫苗。

本試驗用原核表達載體表達BVDV E0基因時發(fā)現(xiàn)，E0基因所含的密碼子有10%左右是E．coli不常用的稀有密碼子。有資料表明，當(dāng)目的基因中存在過多E．coli不常使用的密碼子時，其在E．coli中的表達量一般很低［6］，所以本試驗在表達E0基因時采用了Rosetta（DE3）菌株，該菌株因可以提供密碼子tRNAs，從而可以顯著提高帶有較多稀有密碼子的E0基因在E．coli中的表達量，試驗結(jié)果也證明E0蛋白得到了較高的表達量。

E0是BVDV編碼蛋白中保守性較E2更高的蛋白，該蛋白上的中和表位產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和HCV的能力，氨基酸序列分析結(jié)果也表明，在此蛋白內(nèi)有一高度保守的結(jié)構(gòu)域，因此E0蛋白更適合做亞單位基因工程疫苗，E0蛋白氨基酸生物信息學(xué)分析也證明了這一點。本研究中所表達的E0蛋白在Western－blot試驗中能與標(biāo)準(zhǔn)毒株制備的抗BVDV陽性血清發(fā)生免疫反應(yīng)，證明了表達的BVDV QHZK株E0蛋白具有良好的抗原性。

［1］ 陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．3版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001．

［2］ Rumenapf T，Unger G，Strauss J H，etal．Processing of the envelope glycoproteins of peativiruses［J］．Journal of Virology，1993，67（6）：3288－3294．

［3］ Hertig C，Stalder H，Peterhans E．Genetic Heterogeneity within the coding region of E2and NS2in strain of bovine viral diarrhea virus［J］．Gene，1995，153（2）：191－195．

［4］ 項勛，段綱．牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒（BVDV）的分子生物學(xué)研究進展［J］．家畜生態(tài)，2004，25（4）：202－204．

［5］ 李佑民，劉振潤．牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒株（長春184株）的分離與鑒定［J］．獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1983，3（3）：113－120．

［6］ Chen T，Inouye M．Suppression of the negative effect of minor argine codons on gene expression，preferential usage of minor codons with in the first 25codons of the Eschiscoli genes［J］．Nucleic Acids Research，1990，18：1465－1473．