趙彩燕，雒曉東，林明欣，蘇巧珍，鄭春葉

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，以運(yùn)動(dòng)減少、肌肉強(qiáng)直和震顫為主要癥狀。主要的病理學(xué)特征為黑質(zhì)(SN)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性。引起帕金森病理改變的確切病因目前尚不清楚，可能與氧化應(yīng)激、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏等有關(guān)，其共同通路為細(xì)胞凋亡[1]。

中藥復(fù)方在帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用上可發(fā)揮多重靶標(biāo)優(yōu)勢(shì)[2]，有很好的應(yīng)用前景。帕病1號(hào)方為治療帕金森病系列驗(yàn)方之一，對(duì)美多芭難以改善的非多巴胺能運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀[3]有顯著臨床療效。本文研究其對(duì)帕金森病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠85只，4～5月齡，體重210～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020。

1.2 試劑及儀器

6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿撲嗎啡(APO)：美國(guó)SIGMA公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、兔IgG SABC-POD試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；腦立體定位儀：上海江灣II型；307-6型臺(tái)式牙鉆車：上海醫(yī)用分析儀器廠；10 μl微量進(jìn)樣器：上海醫(yī)用激光儀器廠；721型分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；圖像分析儀：北航多媒體真彩色病理分析圖文分析系統(tǒng)。

中藥帕病1號(hào)方顆粒劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部統(tǒng)一購(gòu)進(jìn)。藥物組成：烏梅、白芍、山萸肉、當(dāng)歸、熟附子、熟地黃、黃連、川芎、葛根、炙甘草、何首烏、人參、石菖蒲，按顆粒藥實(shí)際重計(jì)，每劑43 g。

1.3 造模

大鼠腹腔注射阿撲嗎啡0.5 mg/kg，無(wú)旋轉(zhuǎn)行為。10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。頭部毛發(fā)備皮，固定于腦立體定位儀上，參照文獻(xiàn)方法[4]確定左側(cè)紋狀體(CPU)兩點(diǎn)坐標(biāo)：前囟嘴側(cè)1.6 mm，中線左側(cè)2.8 mm，深5.0 mm；前囟尾側(cè)1.0 mm，中線左側(cè)旁開4.5 mm，深5.0 mm。在相應(yīng)部位用牙科鉆鉆透顱骨，微量進(jìn)樣器吸取5 μg/μl 6-OHDA，緩慢進(jìn)針達(dá)預(yù)定深度，以1 μl/min速度注入，留針10 min，緩慢退出，縫合皮膚。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

術(shù)后1、2、3周行旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。大鼠腹腔注射阿撲嗎啡0.5 mg/kg，10 min后記錄30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向右側(cè)，且最大轉(zhuǎn)速＞7 r/min，30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)＞150轉(zhuǎn)，視為造模成功[5]。治療后同法測(cè)試。

1.5 分組

造模成功的大鼠40只，完全隨機(jī)法分為模型組12只，高劑量組14只，低劑量組14只；另加正常組8只。高劑量組、低劑量組分別給予帕病1號(hào)方顆粒18 g/kg、9 g/kg，均以蒸餾水4 ml溶解藥物灌胃；正常組、模型組予蒸餾水4 ml灌胃。每天1次，共32 d。

1.6 紋狀體SOD活性、GSH和MDA含量測(cè)定

治療后第2天，10%水合氯醛深度麻醉動(dòng)物，處死大鼠。冰枕上迅速取腦，冰生理鹽水中快速去除腦膜和血管，分離大鼠左側(cè)紋狀體，冰生理鹽水中漂洗除去血液，精密稱重，加入9倍生理鹽水冰浴勻漿。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)勻漿上清液中SOD活性、GSH及MDA含量，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 P-Akt、Bcl-2及Bax免疫組織化學(xué)染色(SABC法)

10%水合氯酸深度麻醉，左胸前壁縱行剪開心包，暴露心臟，剪開右心耳，左心尖處插入灌流針。先用PBS進(jìn)行灌流，待血液沖洗干凈后，再灌流4%多聚甲酸300 ml，斷頭取中腦，置4%多聚甲酸緩沖液固定24 h以上，脫水、常規(guī)石蠟包埋。參照?qǐng)D譜，每只大鼠中腦黑質(zhì)部位各取21張切片，每個(gè)指標(biāo)用7張。參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行P-Akt、Bcl-2和Bax免疫組化染色，對(duì)照組切片用0.1 mol/L PBS代替一抗。鏡下胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)果以每組每個(gè)視野免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的平均數(shù)表示。所有資料均由分析系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算并打印。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

正常組未誘導(dǎo)出旋轉(zhuǎn)行為。模型組大鼠治療前后旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各PD組大鼠治療前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；治療后，各PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有非常高度顯著性差異(P＜0.001)；且其中高、低劑量組治療后旋轉(zhuǎn)行為均顯著改善(P＜0.001)，并明顯低于模型組(P＜0.01)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 氧化應(yīng)激反應(yīng)

與正常組相比，模型組SOD活性及GSH含量均明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，高劑量組SOD活性(P＜0.01)、GSH含量(P＜0.01)明顯提高，MDA含量明顯降低(P＜0.01)；低劑量組SOD活性無(wú)顯著改變(P=0.594)，GSH含量明顯提高(P＜0.01)，MDA含量明顯降低(P＜0.01)。與低劑量組相比，高劑量組SOD活性無(wú)顯著改變(P=0.187)，GSH含量明顯提高(P＜0.01)，MDA含量明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 免疫組織化學(xué)

與正常組比較，模型組P-Akt(ser 473)、Bcl-2、Bax陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及Bc1-2/Bax比值均存在非常顯著性差異(P＜0.01)；與模型組相比，高、低劑量組P-Akt(ser 473)、Bcl-2、Bax陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及Bc1-2/Bax比值均存在顯著性差異(P＜0.05)，且高、低劑量組間上述指標(biāo)存在顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較

組別正常組模型組高劑量組低劑量組14 14 n81 2 FP MDA(nmol/mg)5.31±0.45a 10.62±0.74 7.68±0.30a,b 8.85±0.40a 100.015 0.000 SOD(U/mg)113.82±4.72a 90.29±6.74 102.54±6.71a 95.64±3.05 16.106 0.000 GSH(mg/g)6.98±0.21a 4.20±0.33 5.90±0.31a,b 5.06±0.12a 103.481 0.000

表3 各組大鼠陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及Bcl-2/Bax比值比較

3 討論

帕金森病屬于中醫(yī)學(xué)中“顫病”、“振掉”及“震顫”范疇，帕病1號(hào)方源出于《傷寒論》厥陰病主方烏梅丸，方中烏梅以養(yǎng)肝柔筋，熟地黃、山萸肉及何首烏以補(bǔ)益肝腎，當(dāng)歸及葛根解肌以升津，白芍養(yǎng)血柔筋，全方共奏滋養(yǎng)肝腎、濡養(yǎng)經(jīng)脈之功。中藥藥理研究表明，何首烏可增加腦勻漿中多巴胺水平，降低帕金森病大鼠左旋多巴誘發(fā)的腦內(nèi)羥自由基的增高[6]。人參皂甙Rg1是人參的提取物，可通過(guò)下調(diào)核因子-κB信號(hào)通路以及Akt和ERK1/2的激活而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[7]。另外，當(dāng)歸、白芍、黃連和甘草中的有效成分均具有抗痙孿和降低肌張力的作用。

神經(jīng)毒素6-OHDA被廣泛應(yīng)用體內(nèi)和體外帕金森病造模。6-OHDA被注射到紋狀體后，黑質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生延遲的退行性變性，持續(xù)1～3周。單側(cè)紋狀體損毀制備的模型，病理和生化表現(xiàn)與人類帕金森病有很多相似之處，如黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，膠質(zhì)細(xì)胞增生[8]。

阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)原理是6-OHDA紋狀體注射后，造成黑質(zhì)神經(jīng)元的毀損；此時(shí)患側(cè)黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺D-2受體代償性增加，敏感性增高，呈超敏現(xiàn)象[9]，多巴胺受體激動(dòng)劑阿撲嗎啡可使動(dòng)物模型向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為。阿撲嗎啡誘導(dǎo)后的大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的損毀程度正相關(guān)，因此檢測(cè)造模大鼠的旋轉(zhuǎn)行為可以衡量單側(cè)6-OHDA損傷后果[10]。本研究顯示，模型組左側(cè)黑質(zhì)-紋狀體通路受損而致向右側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為，且治療前后旋轉(zhuǎn)行為無(wú)差異，故本實(shí)驗(yàn)帕金森病大鼠模型穩(wěn)定可靠。予帕病1號(hào)方顆粒干預(yù)后，高、低劑量組與同期模型組比較，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均出現(xiàn)不同程度減少，提示帕病1號(hào)方可以改善6-OHDA對(duì)毀損側(cè)黑質(zhì)-紋狀體通路的損傷，且在改善黑質(zhì)-紋狀體通路的損傷上存在量效關(guān)系。

有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)和自由基損害在帕金森病等神經(jīng)變性疾病中起重要作用[11-12]。帕金森病患者中腦黑質(zhì)區(qū)存在抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，如SOD、GSH等功能異常，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，自由基產(chǎn)生過(guò)多，引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化損害、DNA斷裂和神經(jīng)元凋亡。MDA水平可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[13]。本研究顯示，6-OHDA模型大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)SOD活性及GSH含量均明顯降低，MDA含量明顯升高，提示帕金森病大鼠模型腦組織中存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。高、低劑量組大鼠毀損側(cè)紋狀體內(nèi)SOD活性、GSH及MDA含量與模型組比較均呈現(xiàn)不同程度的差異，尤其是高劑量組差異最為明顯，說(shuō)明帕病1號(hào)方可減輕帕金森病模型大鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化酶系的活性和清除自由基的能力，且呈一定的量效關(guān)系。

多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用[14]。Akt通過(guò)磷酸化抑制凋亡蛋白Bax的活性，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而使得細(xì)胞存活。有研究顯示，在帕金森病患者黑質(zhì)區(qū)致密部Akt和P-Akt嚴(yán)重衰竭[15]。

Bcl-2家族根據(jù)其成員在細(xì)胞凋亡中的作用分為兩類：一類為抗凋亡蛋白，包括Bc1-2等；另一類為促凋亡蛋白，包括Bax等[16]。Bcl-2/Bax比值在中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，比值越高，細(xì)胞存活率越高；測(cè)定Bcl-2/Bax比值有利于判斷是否發(fā)生凋亡。本研究顯示，高、低劑量組P-Akt(ser 473)蛋白表達(dá)、bcl-2蛋白表達(dá)，Bcl-2/Bax比值均不同程度升高，而Bax蛋白表達(dá)不同程度下降，說(shuō)明帕病1號(hào)方能激活A(yù)kt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，且存在一定量效關(guān)系，Akt、Bcl-2和Bax可能是該途徑上起主要作用的靶點(diǎn)。

綜上所述，帕病1號(hào)方顆粒可能主要通過(guò)減輕帕金森病模型大鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，同時(shí)激活A(yù)kt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而共同發(fā)揮其對(duì)帕金森病模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

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