袁新華，王紅麗，鄧慶先

新生兒發(fā)生腦白質(zhì)損傷受多種因素的影響，但其主要原因是圍生期宮內(nèi)感染。宮內(nèi)感染易引起早產(chǎn)，早產(chǎn)兒的主要病理變化為腦白質(zhì)損傷。研究證實(shí)，早期干預(yù)可以促進(jìn)宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠的神經(jīng)行為學(xué)的改善。

神經(jīng)黏附分子NB-3是近年發(fā)現(xiàn)的黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族的Contactin亞家族，集中表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，主要表達(dá)在神經(jīng)元的胞體和軸突中[1]。它對(duì)中樞和周圍神經(jīng)元都有作用，可以促神經(jīng)元黏附以及調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)；不僅具有軸突導(dǎo)向作用，還可以促進(jìn)突觸重塑；可以通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟，進(jìn)而促進(jìn)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的形成。本研究探討宮內(nèi)感染對(duì)腦損傷仔鼠腦組織NB-3的表達(dá)及其運(yùn)動(dòng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)成熟Wistar大鼠90只，其中雌性大鼠60只，雄性大鼠30只，體重220～300 g，由佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)室提供；脂多糖(LPS，血清型055：B5)：美國(guó)SIGMA公司；SABC免疫組化試劑盒、抗神經(jīng)細(xì)胞NB-3特定蛋白抗體：北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備與分組

動(dòng)物室溫(21±1)℃常規(guī)飼養(yǎng)、自由飲食，明暗周期各半。環(huán)境適應(yīng)2周后，于17：00以2∶1(雌∶雄)合籠，次日8：00查陰道涂片，以查得精子為妊娠第0天，孕鼠另籠飼養(yǎng)。孕17 d大鼠予0.1 mg/ml脂多糖380 μg/kg腹腔注射，共2 d；或予等量生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠，去除。仔鼠出生后，取胎盤行HE染色，觀察宮內(nèi)感染情況，判斷標(biāo)準(zhǔn)為大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。隨機(jī)選取脂多糖組仔鼠85只，分為干預(yù)組(n=40)和非干預(yù)組(n=40)；隨機(jī)選取生理鹽水組仔鼠40只為對(duì)照組。干預(yù)組給予豐富康復(fù)訓(xùn)練，對(duì)照組和非干預(yù)組常規(guī)飼養(yǎng)，不給任何干預(yù)。1日齡生理鹽水組、脂多糖組各5只取腦組織做病理檢測(cè)。1日、7日、14日、21日、28日齡對(duì)照組、干預(yù)組、非干預(yù)組各8只。

1.3 早期干預(yù)

1.3.1 早期觸摸 將2日齡干預(yù)組仔鼠托至掌心，用毛刷從頭到尾均勻有力刷動(dòng)，注意不要用力過大，以免產(chǎn)生疼痛。每次20 min，每日1次。同時(shí)給予不同強(qiáng)度及頻率的聲音和燈光刺激干預(yù)至2周齡。

1.3.2 康復(fù)訓(xùn)練 由于小鼠出生后2周開始睜眼，于15日齡開始給予豐富康復(fù)訓(xùn)練。①豐富環(huán)境：每日暴露于豐富環(huán)境中2 h，上、下午各1 h。在60×45×45 cm籠內(nèi)放置不同顏色及形狀的物體，包括轉(zhuǎn)盤、管道、階梯、搖鈴、秋千、斜坡、杠桿以及不同顏色和大小的圓球等，每周將環(huán)境改變2次，以造成新異刺激，第28日齡結(jié)束刺激。非干預(yù)組和對(duì)照組分別飼養(yǎng)于20×30×30 cm標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)，不予干預(yù)。②平衡木訓(xùn)練：平衡木長(zhǎng)170 cm，寬2 cm，平放距地面7 cm處，讓仔鼠在上面行走，10 min/次。③轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練：轉(zhuǎn)棒長(zhǎng)150 cm，直徑4.5 cm；中點(diǎn)固定于3 r/min轉(zhuǎn)動(dòng)器上，順、逆時(shí)針交替轉(zhuǎn)動(dòng)，10 min/次。以上每種干預(yù)方法至少間隔1 h。

1.4 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定

對(duì)14日齡、28日齡的仔鼠進(jìn)行懸吊試驗(yàn)。在自然光的安靜房間內(nèi)，使仔鼠前肢抓住距離桌面45 cm的水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，記錄仔鼠從抓握至掉下的時(shí)間。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：1分：＜10 s；2分：10～30 s；3分：30 s～2 min；4分：2～5 min；5分：≥5 min。

1.5 NB-3檢測(cè)

不同日齡仔鼠麻醉下從心耳部位進(jìn)行灌洗后，迅速斷頭、取腦，將完整大腦置于中性甲醛溶液中固定。各例石蠟包埋組織均取5 μm切片6張，5張行NB-3免疫組化染色，1張用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用SABC法進(jìn)行組化染色。

光鏡(40×10)下NB-3陽性細(xì)胞胞體和軸突周圍為棕黃色。每個(gè)大鼠取6張切片，40×物鏡下每個(gè)切片取相互不重疊的4個(gè)視野，應(yīng)用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件計(jì)算NB-3免疫陽性細(xì)胞積分光密度(IOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

注射脂多糖后，孕鼠的活動(dòng)、進(jìn)食均減少，3只提前分娩，5只死亡，其余37只順利生產(chǎn)，共娩出足月活產(chǎn)仔鼠225只，死產(chǎn)仔鼠35只。脂多糖組仔鼠身體顏色青紫、精神萎靡、進(jìn)食減少、行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少、體重低。生理鹽水組孕鼠無異常反應(yīng)，共娩出足月活產(chǎn)鼠120只，足月仔鼠出生后身體顏色淡紅，反應(yīng)靈敏，體重正常。

2.2 子宮和胎盤的檢測(cè)

脂多糖組孕鼠胎盤可見血管充血、水腫，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。生理鹽水組孕鼠胎盤未見明顯炎癥反應(yīng)。

2.3 腦組織病理學(xué)改變

脂多糖組新生仔鼠腦組織HE染色可見白質(zhì)、胼胝體、內(nèi)囊部位組織疏松，膠質(zhì)細(xì)胞聚集，囊間少突膠質(zhì)細(xì)胞減少，腦室內(nèi)出血、腦白質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張充血、腦白質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管破裂出血。對(duì)照組新生仔鼠腦組織HE染色可見白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，布局有序，核淡，核仁清楚。

2.4 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

14日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，非干預(yù)組仔鼠反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、平衡性差、肌力差、肌張力高，懸吊時(shí)肢體自主活動(dòng)明顯減少，下肢顫抖增多，懸吊持續(xù)時(shí)間短，測(cè)試得分明顯降低(P＜0.01)；對(duì)照組測(cè)試得分明顯優(yōu)于干預(yù)組(P＜0.01)；干預(yù)組測(cè)試得分優(yōu)于非干預(yù)組(P＜0.05)。28日齡時(shí)，干預(yù)組懸吊時(shí)間與對(duì)照組接近，測(cè)試得分無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.5 NB-3表達(dá)

1日齡干預(yù)組和非干預(yù)組NB-3陽性細(xì)胞IOD無顯著性差異(P＞0.05)，其他日齡對(duì)照組和非干預(yù)組NB-3陽性細(xì)胞密度值較干預(yù)組低。見表2。

表1 各組仔鼠懸吊試驗(yàn)評(píng)分

表2 各組仔鼠腦組織NB-3陽性細(xì)胞表達(dá)(IOD)

3 討論

大腦的發(fā)育過程十分復(fù)雜，并且具有其獨(dú)特的敏感時(shí)期。因此，發(fā)育中的大腦比成年大腦更容易受到傷害。在發(fā)育敏感期內(nèi)，機(jī)體內(nèi)部或者外部因素的影響都可能使大腦的發(fā)育過程推遲或終止。但中樞神經(jīng)損傷后具有一定程度的可塑性，可塑性與動(dòng)物物種、年齡、損傷部位和程度、藥物作用、功能訓(xùn)練和學(xué)習(xí)等因素密切相關(guān)。因此，尋找可塑性的分子證據(jù)對(duì)豐富可塑性理論具有重要意義。

豐富康復(fù)訓(xùn)練由豐富環(huán)境和一般康復(fù)訓(xùn)練組成，兩者共同作用可以使大腦功能達(dá)到最佳恢復(fù)狀態(tài)。研究證明，不同的康復(fù)手段會(huì)產(chǎn)生不同的康復(fù)效果。廣泛的皮質(zhì)損傷可使腦組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，對(duì)損傷區(qū)域的刺激可促進(jìn)功能恢復(fù)。但單純?cè)黾恿α康挠?xùn)練并不能誘導(dǎo)腦組織重塑，必須配合技巧訓(xùn)練[2]。研究顯示，簡(jiǎn)單運(yùn)動(dòng)方式，如強(qiáng)迫性跑籠訓(xùn)練僅可促進(jìn)腦血管生成，而復(fù)雜技巧訓(xùn)練如轉(zhuǎn)棒和雜技可增加腦皮層突觸數(shù)量[3-4]。現(xiàn)己證實(shí)，腦區(qū)所做任務(wù)的多少和任務(wù)的性質(zhì)可以決定樹突分支的復(fù)雜性。

豐富康復(fù)訓(xùn)練可以誘導(dǎo)腦缺血周邊區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)起作用，而且在腦損傷時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用，并能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)[4-5]。

本研究顯示，隨著日齡的增加，腦損傷仔鼠的運(yùn)動(dòng)功能均有所改善，早期干預(yù)可以進(jìn)一步提高腦損傷鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

神經(jīng)細(xì)胞黏附分子NB-3是近年發(fā)現(xiàn)的黏附分子，也被稱為contactin-6，是一個(gè)糖基磷脂酰肌醇相連的免疫球蛋白超家族的contactin細(xì)胞亞群的識(shí)別分子，并且明確地表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)，具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、分化的作用[1,6-7]。Takeda等研究發(fā)現(xiàn)，無論NB-3以可溶性形式還是以底物形式存在，都具有促神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的作用，并與NB-3的量成正比關(guān)系[8]。Cui等發(fā)現(xiàn)，NB-3的表達(dá)與少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育是一致的，并且可以通過一系列機(jī)制促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化及成熟[9]。NB-3在包括小腦在內(nèi)的腦的大部分區(qū)域都有表達(dá)，它的表達(dá)在出生后突然增高，并且在小鼠出生后第7天達(dá)到高峰，第2～3周進(jìn)入平臺(tái)期，這時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育已進(jìn)入最后階段[6,8]。

本研究顯示，1日齡脂多糖組小鼠NB-3表達(dá)較生理鹽水組高，7日齡各組總體表達(dá)較1日齡高，14日齡較7日齡低，28日齡更低，這與Lee等的研究結(jié)果一致。相同時(shí)間段上，干預(yù)組較非干預(yù)組和對(duì)照組腦組織NB-3的表達(dá)高。提示，隨著年齡的增長(zhǎng)，NB-3的表達(dá)增高；早期干預(yù)可以進(jìn)一步提高NB-3的表達(dá)，在達(dá)到高峰后有所下降，并維持在一定水平上。

本研究顯示，早期干預(yù)不僅可以改善腦損傷仔鼠的運(yùn)動(dòng)功能，還可以提高神經(jīng)黏附分子NB-3的表達(dá)。由于NB-3具有促神經(jīng)元黏附及軸突導(dǎo)向作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)方面具有一定的意義。早期干預(yù)對(duì)宮內(nèi)感染致腦損傷鼠的運(yùn)動(dòng)功能的提高，機(jī)制之一可能是由于通過提高NB-3的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

我們推測(cè)，能誘導(dǎo)NB-3表達(dá)增加的因素可能促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。神經(jīng)黏附分子NB-3的表達(dá)可能是環(huán)境刺激影響發(fā)育期腦損傷修復(fù)的機(jī)制之一。

[1]Ogawa J,Kaneko H,Masuda T,et al.Novel neural adhesion molecules in the Contactin/F3 subgroup of the immunoglobulin superfamily：isolation and characterization of cDNAs from rat brain[J].Neurosci Lett,1996,218(3)：173-176.

[2]Studenski S,Carlson MC,Fillit H,et al.From bedside to bench：does mental and physical activity promote cognitive vitality in late life?[J].Sci Aging Knowledge Environ,2006,28：21-23.

[3]Adlard PA,Perreau VM,Pop V,et al.Voluntary exercise decreases amyloid load in a transgenic model of Alzheimer's disease[J].J Neurosci,2005,25：4217-4221.

[4]Kleim JA,Jones TA,Schallert T.Motor enrichment and the induction of plasticity before or after brain injury[J].Neurochem Res,2003,28：1757-1769.

[5]Ding Y,Li J,Clark J,et al.Synaptic plasticity in thalamic nuclei enhanced by motor skill training in rat with transient middle cerebral artery occlusion[J].Neurol Res,2003,25：189-194.

[6]Lee S,Takeda Y,Kawano H,et al.Expression and regulation of a gene encoding neural recognition molecule NB-3 of the contactin/F3 subgroup in mouse brain[J].Gene,2000,245(2)：253-266.

[7]Kunie S,Toyoshima M,Takeda Y,et al.Synaptic formation in subsets of glutamatergic terminals in the mouse hippocampal formation is affected by a deficiency in the neural cell recognition molecule NB-3[J].Neurosci Lett,2010,473(2)：102-106.

[8]Takeda Y,Akasaka K,Lee S,et al.Impaired motor coordination in mice lacking neural recognition molecule NB-3 of the contactin/F3 subgroup[J].J Neurobiol,2003,56(3)：252-265.

[9]Cui XY,Hu QD,Tekaya M,et al.NB-3/Notch1 pathway via Deltex1 promotes neural progenitor cell differentiation into oligodendrocytes[J].J Biol Chem,2004,279(24)：25858-25865.