王蕾，彭吾訓(xùn)，張愛華，鄧進，龔躍昆，李世和，胡蘊玉

股骨頭壞死(femoral head necrosis,FHN)的治療一直是國內(nèi)外的一大難題[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)具有高效誘導(dǎo)成骨活性[2]；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能夠促進BMP誘導(dǎo)成骨，而且是一種促血管生長因子[3]。本研究采用豬椎骨為原料制備雙相陶瓷生物骨(biphasic ceramic biologic bone,BCBB)，將BMP和bFGF復(fù)合到BCBB支架上[4]，并移植到微波滅活建立的兔FHN模型病灶清除區(qū)[5]，評價BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物對FHN的修復(fù)能力。

1 材料與方法

1.1 BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物的制備

參照彭吾訓(xùn)等的方法制備BCBB。以Ⅰ型膠原修飾BCBB，將BMP和bFGF按比例與BCBB復(fù)合，制備BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物[4]。

1.2 實驗動物及分組

新西蘭成年大白兔32只，雌雄不限，平均體重2.9 kg(2.7～3.5 kg)，微波55℃滅活10 min建立兔雙側(cè)股骨頭壞死模型[5]。將64側(cè)股骨頭隨機分為4組，每組16側(cè)股骨頭：A組為空白對照；B組植入BCBB/BMP；C組植入BCBB/BMP/bFGF；D組植入自體松質(zhì)骨(髂骨)。

1.3 植入方法

造模后8周，按造模時的手術(shù)入路，刮除股骨頭50%左右松質(zhì)骨，A組不植入任何材料，其余各組按計劃分別植入不同材料。為了避免不同移植物相互作用，在同一只兔的兩側(cè)股骨頭作相同處理。所有動物術(shù)前30 min肌注慶大霉素40,000 U，術(shù)后每天肌注40,000 U，連用3 d。術(shù)后分籠飼養(yǎng)。觀察動物的一般情況、食欲及切口愈合情況。

1.4 取材及觀察指標(biāo)

分別于術(shù)后2周、4周、8周和12周采用靜脈空氣栓塞分批處死動物，每個時間點每組取材4側(cè)股骨頭，進行大體標(biāo)本觀察、X線攝片、組織學(xué)觀察、血管免疫組織化學(xué)染色。

1.4.1 大體及解剖觀察 取材后觀察股骨頭表面情況及有無塌陷變形。沿股骨頭冠狀面剖開，肉眼觀察股骨頭缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.4.2 X線攝片 取材后立即行X線攝片，統(tǒng)一攝片條件為60 kV、50 mA、0.12 s。觀察股骨頭缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.4.3 組織學(xué)觀察和組織學(xué)新骨形成面積比較 標(biāo)本制成5μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察。對每個時間點的每個標(biāo)本隨機選取1張切片，在每張切片的植骨區(qū)(空白組為缺損區(qū))隨機選取3個100倍視野，觀察新骨形成面積。根據(jù)體視學(xué)德萊塞原理[6]，參照空間內(nèi)某種特征物的面積分?jǐn)?shù)是其體積分?jǐn)?shù)的估計，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)進行圖像分析，測算新骨形成的面積百分比。

1.4.4 血管免疫組織化學(xué)染色及血管面積比較 采用CD34單克隆抗體(邁新試劑公司)對2周、4周、8周每個股骨頭的組織切片進行免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片厚4μm，按常規(guī)ABC法進行免疫組化染色。陽性染色表現(xiàn)為棕黃色，定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，以已知的陽性組織切片為陽性對照。每個股骨頭隨機選取1張免疫組化染色切片，在每張切片的原缺損區(qū)隨機選取3個100倍視野，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)測定血管面積百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析處理，采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有動物無死亡，術(shù)后當(dāng)天開始進食，傷口未發(fā)生紅腫、滲出等炎癥反應(yīng)，切口Ⅰ期愈合。

2.2 大體解剖觀察

2周時，A組缺損區(qū)為血塊和纖維組織填充；B組BCBB孔隙內(nèi)有組織長入；C組纖維組織長活躍；D組自體骨孔隙內(nèi)和表面有組織生長。4周時，A組缺損區(qū)為纖維組織填充；B組BCBB孔隙內(nèi)長滿組織；C組組織長活躍，顏色紅潤；D組自體骨孔隙內(nèi)和表面長滿組織。8周時，A組缺損區(qū)清晰可見，有1側(cè)股骨頭塌陷；B組BCBB空隙內(nèi)長滿組織，BCBB吸收；C組植骨區(qū)與宿主骨界限模糊；D組植骨區(qū)與宿主骨界限不清。12周時，A組有1側(cè)股骨頭塌陷，缺損區(qū)只有少量類骨組織形成(圖1)；B組有大量新骨形成，植骨區(qū)與宿主骨界限依然存在(圖1)；C組植骨區(qū)與宿主骨界限不清(圖1)；D組植骨區(qū)結(jié)構(gòu)接近宿主骨(圖1)。

2.3 X線攝片

2周時，A組缺損清晰可見；B組骨移植區(qū)呈高密度影；C組骨移植區(qū)高密度影；D組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當(dāng)。4周時，A組缺損略有縮??；B組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當(dāng)；C組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當(dāng)；D組骨移植區(qū)密度低于宿主骨。8周時，A組時缺損仍然存在；B組骨移植區(qū)密度不均；C組骨移植區(qū)與宿主骨界限清楚；D組骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊。12周時，A組缺損仍然存在，有1側(cè)股骨頭塌陷(圖2)；B組骨移植區(qū)呈高密度影，骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊(圖2)；C組骨移植區(qū)高密度稍高，骨移植區(qū)與宿主骨界限模糊(圖2)；D組骨移植區(qū)密度與宿主骨相當(dāng)，與宿主骨界限不清(圖2)。

2.4 組織學(xué)觀察

2周時，A組以血塊及纖維組織為主；B組纖維組織在BCBB孔隙內(nèi)生長，炎性細(xì)胞少；C組纖維組織在BCBB孔隙內(nèi)生長活躍，炎性細(xì)胞少；D組纖維組織長入自體松質(zhì)骨孔隙內(nèi)，未見炎性細(xì)胞。4周時，A組有少量類骨組織形成(圖3)；B組有少量新骨組織形成，BCBB吸收不全(圖3)；C組有大量新骨組織形成，BCBB吸收不全(圖3)；D組有大量新骨組織形成，自體骨移植大部分吸收(圖3)。8周時，A組有類骨組織形成，伴有少量間充質(zhì)干細(xì)胞；B組有新骨組織形成，BCBB吸收不全；C組有大量新骨組織和成骨細(xì)胞，BCBB吸收不全；D組有大量新骨組織形成，自體骨移植已完全吸收。12周時，A組缺損區(qū)只有類骨組織形成，仍以纖維組織為主；B組BCBB吸收不全；C組骨改建正在進行，植骨區(qū)與宿主骨界限不清，在骨移植區(qū)與宿主骨之間可見連續(xù)骨小梁通過，BCBB吸收不全；D組時骨改建已基本完成，結(jié)構(gòu)接近正常松質(zhì)骨。

圖1 術(shù)后12周大體解剖觀察

圖2 術(shù)后12周X線片

圖3 術(shù)后4周HE染色(100×)

組織學(xué)新骨形成面積比較：4周、8周、12周時，D組和C組優(yōu)于B組和A組，B組優(yōu)于A組(P＜0.05)，C組和D組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。2.5血管免疫組織化學(xué)染色

2周、4周和8周時血管免疫組織化學(xué)染色顯示，A組、B組、D組血管較少，C組最多，吻合成網(wǎng)(圖4)。2周、4周和8周血管免疫組織化學(xué)染色圖像分析結(jié)果顯示，C組血管面積最大，A組最小，C組與A組、B組、D組間比較有顯著性差異(P＜0.05)，A組、B組、D組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

3 討論

FHN若不治療，至少有80%在4年內(nèi)會出現(xiàn)塌陷，而單純非手術(shù)治療往往不能阻止這種情況的發(fā)生[1]。由于該病患者大多數(shù)為中青年，行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后遠(yuǎn)期效果并不令人滿意[7]。因此，人們更關(guān)注保留股骨頭的療法。保留股骨頭的手術(shù)治療方法包括單純髓腔減壓、髓腔減壓加單純骨移植術(shù)、髓腔減壓加血管束植入或帶血管骨移植術(shù)、截骨術(shù)等。由于各種術(shù)式的療效不一，仍沒有一種滿意的術(shù)式被廣泛接受[8]。

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用骨組織工程技術(shù)修復(fù)FHN有可能成為改善FHN治療效果的一個突破口[8]。BMP和bFGF是近年來研究得較深入的兩種骨生長因子[9]。BMP能夠誘導(dǎo)未分化骨髓干細(xì)胞(MSCs)向軟骨母細(xì)胞和骨母細(xì)胞分化[10]，bFGF對已分化的MSCs具有促增殖作用，而且是一強大的血管生長因子[11]。故本研究將BMP和bFGF按比例復(fù)合到BCBB支架上，制備BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物[4]，并用以修復(fù)兔股骨頭壞死模型。

圖4 術(shù)后2周CD34免疫組化染色(100×)

BCBB用豬椎骨煅燒而成，具有天然網(wǎng)孔系統(tǒng)和一定強度，由79%羥基磷灰石(HA)和17%磷酸三鈣(TCP)組成，HA的含量影響其降解速度[4]。本研究中，BCBB較自體松質(zhì)骨吸收緩慢，這是因為BCBB移植在股骨頭這樣的承重部位，在非承重部位可以增加TCP的含量從而加快材料降解速度。

BMP能夠誘導(dǎo)未分化MSCs向軟骨母細(xì)胞和骨母細(xì)胞分化[2,12]，bFGF對已分化的MSCs具有促增殖作用[3,13-14]。本研究顯示，4周、8周、12周時，C組新骨形成面積大于B組，B組大于A組，表明BMP在體內(nèi)通過誘導(dǎo)未分化MSCs向軟骨母細(xì)胞和骨母細(xì)胞分化，促進了骨形成。bFGF和BMP具有協(xié)同作用，bFGF通過對已分化的MSCs的促增殖作用，加強了BMP新骨形成作用，BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物修復(fù)股骨頭壞死模型的成骨效果優(yōu)于BCBB/BMP。

股骨頭缺血性壞死的主要矛盾是骨缺血[15]。bFGF是強大的血管生長因子[3]。本研究顯示，4周和8周時，C組血管面積大于B組，新骨形成面積也大于B組，提示bFGF發(fā)揮了明顯的再血管化作用，有可能通過促進血管形成，改善股骨頭血供，帶來更多的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，從而加速新骨形成和FHN修復(fù)；同時，支架材料BCBB是bFGF的良好載體，適合新生血管長入。

自體骨移植被譽為骨移植金標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究顯示，4周、8周和12周時，新骨形成面積C組與D組間無顯著性差異，表明BCBB/BMP/bFGF促進FHN修復(fù)的成骨潛能與自體骨移植相當(dāng)。

本研究不是股骨頭壞死的病理機制研究，因此采用微波滅活建立股骨頭壞死模型[5,16]。A組的病理經(jīng)過表明，該方法所建立的模型是可行的，單純進行病灶清除而不行植骨治療，不能夠自行修復(fù)。

表1 各組新骨形成面積比較(%)

表2 各組血管面積比較(%)

總之，本研究顯示，采用BCBB/BMP/bFGF復(fù)合物移植，對兔FHN模型骨修復(fù)效果與自體骨移植相當(dāng)。不足之處在于缺乏細(xì)胞免疫和體液免疫等方面觀察。如其安全性得到證實，則有望為臨床上股骨頭壞死的治療提供一種有效方法。

[1]Cao K,Huang W,An H,et al.Deproteinized bone with VEGF gene transfer to facilitate the repair of early avascular necrosis of femoral head of rabbit[J].Chin J Traumatol,2009,12(5)：269-274.

[2]Wang L,Huang Y,Pan K,et al.Osteogenic responses to different concentrations/ratios of BMP-2 and bFGF in bone formation[J].Ann Biomed Eng,2010,38(1)：77-87.

[3]Nakamura S,Nambu M,Ishizuka T,et al.Effect of controlled release of fibroblast growth factor-2 from chitosan/fucoidan micro complex-hydrogel on in vitro and in vivo vascularization[J].J Biomed Mater Res A,2008,85(3)：619-627.

[4]彭吾訓(xùn),王蕾,李彥林,等.雙相陶瓷生物活性骨的制備及其細(xì)胞相容性研究[J].中國矯形外科雜志,2008,16(19)：1496-1498.

[5]彭吾訓(xùn),王蕾,鄧進,等.微波滅活建立兔股骨頭壞死模型：最適合滅活溫度和時間的篩選[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(2)：390-393.

[6]Thomopoulos S,Harwood FL,Silva MJ,et al.Effect of several growth factors on canine flexor tendon fibroblast proliferation and collagen synthesis in vitro[J].J Hand Surg Am,2005,30(3)：441-447.

[7]Chen W,Zhang F,Chang SM,et,al.Microsurgical fibular flap for treatment of avascular necrosis of the femoral head[J].J Am Coll Surg.2006,202(2)：324-334.

[8]Wen Q,Ma L,Chen YP,et al.Treatment of avascular necrosis of the femoral head by hepatocyte growth factor-transgenic bone marrow stromal stem cells[J].Gene Ther,2008,15(23)：1523-1535.

[9]Varkey M,Kucharshi C,Haque T,et al.In vitro osteogenic response of rat bone marrow cells to bFGF and BMP-2 treatments[J].Clin Orthop Relat Res,2006,443：113-123.

[10]Lim TY,Wang W,Shi Z,et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and osteoblast differentiation on titanium with surface-grafted chitosan and immobilized bone morphogenetic protein-2[J].J Mater Sci Mater Med,2009,20(1)：1-10.

[11]Liu Y,Cai S,Shu XZ,et al.Release of basic fibroblast growth factor from a crosslinked glycosaminoglycan hydrogel promotes wound healing[J].Wound Repair Regen,2007,15(2)：245-251.

[12]Chen B,Lin H,Wang J,et al.Homogeneous osteogenesis and bone regeneration by demineralized bone matrix loading with collagen-targeting bone morphogenetic protein-2[J].Biomaterials,2007,28(6)：1027-1035.

[13]Stewart K,Pabbruwe M,Dickinson S,et al.The effect of growth factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds[J].Tissue Eng,2007,13(2)：271-280.

[14]Shi YH,Bingle L,Gong LH,et al.Basic FGF augments hypoxia induced HIF-1-alpha expression and VEGF release in T47D breast cancer cells[J].Pathology,2007,39(4)：396-400.

[15]Kerachian MA,Harvey EJ,Cournoyer D,et al.Avascular necrosis of the femoral head：vascular hypotheses[J].Endothelium,2006,13(4)：237-244.

[16]Sbordone L,Toti P,Menchini FG,et al.Implant survival in maxillary and mandibular osseous onlay grafts and native bone：a 3-year clinical and computerized tomographic follow-up[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2009,24(4)：695-703.