王 紅 英, 劉 德 祎, 錢 斯 日 古 楞, 李 長 清, 孫 井 輝

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

RNA是生物體內(nèi)基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ),與生物生長情況有密切的關(guān)系。雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)(RNA interference,簡稱RNAi)[1]。小干擾RNA(Small interferance RNA, 簡稱siRNA),可作為RNAi技術(shù)的引發(fā)物,致使與其對應(yīng)的mRNA失去功能,以此來達到治療疾病的作用[2-4]?；趕iRNA的RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究、抗病毒治療、腫瘤治療以及基因治療等諸多領(lǐng)域,RNAi技術(shù)將展現(xiàn)出越來越獨特的治療優(yōu)勢。然而,目前采用的直接靜脈注射siRNA的治療方法,存在siRNA在體內(nèi)傳遞時間過長,容易被降解等弱點[5-6]。如何使siRNA更加穩(wěn)定,并使它快速到達到目的部位的新型給藥系統(tǒng)的研究成為熱門。磁性微球是一種新型靶向給藥載體。以磁性微球為載體制備的靶向藥物,通過磁場的引導(dǎo),能夠使藥物在體內(nèi)快速運輸,在目的部位富集,從而提高療效,減輕藥物對其他部位的不良影響。通過磁性固定化技術(shù)使siRNA快速到達目的部位,避免運輸過程中的降解,從而實現(xiàn)RNAi技術(shù)在實際醫(yī)療上的應(yīng)用。本文的目的是通過對酵母RNA的磁性固定條件的研究,探索siRNA的磁性固定和新型給藥方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

啤酒酵母,大連華潤啤酒廠提供；殼聚糖,分析純,上海緣聚生物科技有限公司；溶菌酶,研域(上海)化學(xué)試劑有限公司；鉬酸銨,天津市大茂化學(xué)試劑廠；戊二醛,天津基準化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 納米級磁性殼聚糖微球的制備

用共沉淀法[7]制備納米級磁流體。將2 g改性的磁流體和30 mL用乙酸(體積分數(shù)2%)溶解的殼聚糖溶液加入燒杯中,在功率1 000 W、間隙時間1.5 s、超聲時間1.5 s條件下,超聲波冰浴分散10 min。將分散好的溶液置入500 mL三口燒瓶內(nèi),加入150 mL去離子水,37 ℃恒溫水浴加熱并1 000 r/min攪拌。緩慢滴加100 μL質(zhì)量分數(shù)為50%的戊二醛,攪拌30 min,將1 mol/L的NaOH以30 s一滴的速度滴加1 h。然后800 r/min 攪拌30 min。停止攪拌,用磁場沉降溶液,將沉淀用蒸餾水反復(fù)清洗,冷凍干燥,在4 ℃的冰箱中保藏[8]。

1.2.2 酵母RNA的提取

采用苯酚法提取酵母RNA[9]。取1 g新鮮酵母在研缽中研碎,用10 mL SDS-緩沖液(0.3% SDS, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L 乙酸鈉,pH 5.0)將酵母粉末洗入試管,再加入0.1 mL溶菌酶(1 mg/mL)搖勻,室溫下靜置10 min；加入等體積飽和苯酚液(重蒸苯酚用SDS-緩沖液飽和),劇烈振蕩5 min后,在 10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。取上清液,加等體積氯仿-異戊醇(體積比為24∶1),室溫下劇烈振蕩2.5 min后在10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。取上清液,加2倍體積95%乙醇(含2%乙酸鉀),冰浴靜置30 min,使RNA 沉淀,在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,棄上清液,沉淀用少量無水乙醇和乙醚各洗一次后進行冷凍干燥,得到灰白色RNA粉末。

1.2.3 酵母RNA的磁性固定

稱取10 mg磁性殼聚糖微球,用3%的戊二醛溶液活化2 h[10]。用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗干凈,用蒸餾水定容至10 mL(質(zhì)量濃度為1 mg/mL),加入一定體積的酵母RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),再加入一定體積的戊二醛(質(zhì)量分數(shù)為50%),40 ℃水浴搖床振蕩一定時間,得到磁性固定化的酵母RNA。用磁場將磁性固定化的RNA沉淀,用蒸餾水反復(fù)清洗沉淀,收集上清液,定容至一定體積,用定磷法測量其總磷含量?？偭缀恳設(shè)D值體現(xiàn),OD值越高,說明固定效果越差。

1.2.4 正交設(shè)計RNA的固定化條件的優(yōu)化

采用正交法對酵母RNA磁性固定化主要影響因素進行優(yōu)化,L9(33)正交試驗方案見表1。其余條件為磁性微球10 mL(質(zhì)量濃度為1 mg/mL),RNA溶液20 mL(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),戊二醛100 μL(質(zhì)量分數(shù)為50%)。

表1 正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母RNA磁性固定化條件

2.1.1 固定化最佳時間的確定

取8只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球、20 mL RNA溶液,調(diào)節(jié)pH為7,交聯(lián)劑戊二醛加入量為200 μL,分別在40 ℃下恒溫振蕩1、2、3、4、5、6、7、8 h。用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖1可見,隨著固定化時間的延長,固定化RNA總磷含量先降低后增加。固定化時間過短,有部分RNA和載體沒有結(jié)合,因而固定化效率很低；固定化時間過長時,在振蕩條件下固定化的RNA開始脫落。因此最佳固定化時間確定為4 h。

圖1 固定化時間對RNA固定化的影響

Fig.1 Effect of time on the immobilization of magnetic microspheres

2.1.2 固定化最佳溫度的確定

取7只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球,20 mL RNA溶液,調(diào)節(jié)pH為7,交聯(lián)劑戊二醛加入量為200 μL,分別在20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下振蕩4 h。用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖2可見,隨著固定化溫度的提高,上清液中RNA總磷含量逐漸降低,40 ℃時達到最低,當溫度超過40 ℃,上清液中RNA總磷含量逐漸提高。因此RNA磁性固定化最佳反應(yīng)溫度確定為40 ℃。

圖2 溫度對RNA固定化的影響

Fig.2 Effect of the temperature on the immobilization of magnetic microspheres

2.1.3 固定化RNA最佳添加量的確定

取7只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球,每只三角瓶中分別加入5、10、15、20、25、30、35 mL RNA溶液,40 ℃恒溫振蕩4 h,用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖3可知,當RNA添加量不足20 mL時,固定化后的上清液中游離的RNA很少,這說明少于20 mL添加量的RNA固定化的效率很高。當RNA的加量超過20 mL時,上清液中的游離RNA量逐漸增大,這說明微球固定RNA達到飽和,繼續(xù)增加RNA添加量,只是上清液中RNA含量增加,不會提高RNA的固定化率。所以,每10 mg磁性殼聚糖微球的最佳RNA添加量為20 mL(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)。

圖3 RNA添加量對磁性微球固定化的影響

Fig.3 Effect of RNA solution content on the immobilization of magnetic microspheres

2.1.4 固定化最佳pH的確定

取7只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球,20 mL RNA溶液,交聯(lián)劑戊二醛加入量為200 μL,分別調(diào)節(jié)溶液pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0,40 ℃條件下振蕩4 h。用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖4可見,在pH為5.5時RNA的磁性固定化效果最好。

圖4 pH對RNA固定化的影響

Fig.4 Effect of the pH on the immobilization of magnetic microspheres

2.1.5 固定化最佳交聯(lián)劑加入量的確定

取6只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球,20 mL RNA溶液,分別調(diào)節(jié)溶液pH為5.5,交聯(lián)劑戊二醛加入量分別為0、100、200、300、400、500 μL,40 ℃條件下振蕩4 h。用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖5可見,交聯(lián)劑戊二醛最佳加入量為100 μL,加入超過300 μL后會使磁性殼聚糖微球粘連。

圖5 戊二醛體積對RNA固定化的影響

Fig.5 Effect of the glutaraldehyde content on the immobilization of magnetic microspheres

2.2 磁性固定化RNA的穩(wěn)定性

取5只100 mL三角瓶,分別加入10 mL活化后的磁性殼聚糖微球,20 mL RNA溶液,調(diào)節(jié)溶液pH為5.5,交聯(lián)劑戊二醛加入量為100 μL,40 ℃條件下振蕩4 h。4 ℃條件分別靜置0、1、2、3、4 h,再用磁場將磁性殼聚糖微球沉淀,分別取上清液2 mL,用定磷法測量其總磷含量。

由圖6可見,磁性固定后,上清液總磷OD值變化不大,說明上清液中RNA總磷含量變化不大,因此,交聯(lián)法磁性固定RNA后的穩(wěn)定性較好。

圖6 交聯(lián)法RNA固定化的穩(wěn)定性

Fig.6 Stability of cross-link on the immobilization of magnetic microspheres

2.3 正交設(shè)計RNA的磁性固定化

采用正交分析方法對酵母RNA磁性固定化主要影響因素進行優(yōu)化。試驗結(jié)果見表2、3。

表2 正交設(shè)計試驗方案及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

由表2、3可見,酵母RNA的磁性固定化最顯著的影響因素是溫度,其次是時間和pH,由于OD值越大,說明固定效率越差,最佳固定條件為A2B2C2,即最佳固定化反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)時間為4 h,溶液pH為5.5。

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明,酵母RNA磁性固定化的最佳條件是:10 mL磁性殼聚糖微球(質(zhì)量濃度為1 mg/mL),加入20 mL的酵母RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),在pH 5.5,反應(yīng)溫度為40 ℃,交聯(lián)劑戊二醛100 μL的條件下反應(yīng)4 h。RNA經(jīng)磁性固定化后,在一定時間內(nèi)表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性,這有利于RNA的靶向?qū)牒驮诨继幍募皶r釋放。

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