李國柱，張宇陽，孟慶艷*

（1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

維藥新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.）為唇形科（Lamiaceae）新塔花屬（Ziziphora）植物，又名唇香草、小葉薄荷、山薄荷，在維吾爾語言中稱之為蘇則[1]。新塔花為多年生半灌木狀草本植物，喜生長于低山坡草地以及干旱坡地，我國僅在新疆有分布，在蒙古和哈薩克斯坦等地區(qū)也有所分布[2]。芳香新塔花作為傳統(tǒng)維吾爾藥材，在新疆民間被廣泛用于治療高血壓病、冠心病等心腦血管疾病[3-4]。全株地上部分均可入藥，其味辛性寒，芳香具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、寧心安神、利水清熱、壯骨強(qiáng)身、清胃消食之功能。主治感冒發(fā)熱、目赤腫痛、頭痛咽痛、心悸失眠等癥[5-6]。現(xiàn)代研究表明，芳香新塔花主要含揮發(fā)油、萜類、生物堿、黃酮類等化學(xué)成分。其中的黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性及營養(yǎng)保健作用[7-8]，研究芳香新塔花中總黃酮的純化工藝對(duì)提高芳香新塔花植物的生物利用率有實(shí)際意義。

目前，對(duì)于維藥芳香新塔花粗提物的研究，多在其提取方法上，而對(duì)于其最優(yōu)純化工藝的研究卻不多。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)芳香新塔花純化工藝的優(yōu)化研究，得出新塔花純化工藝，為以后新塔花屬植物特色資源的利用提供參考。

馮云霞等[9-11]分別采用層析柱、樹脂吸附法對(duì)黃芩和芝麻葉中的黃酮類化合物進(jìn)行了純化，但這些基本都未涉及樹脂的篩選和工藝條件的優(yōu)化以及各因素對(duì)樹脂吸附解析的影響。大孔樹脂預(yù)處理采用王慧彥等[12]在B-8大孔樹脂對(duì)槐花總黃酮吸附性能研究中的方法。本實(shí)驗(yàn)使用XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300、HPD-20樹脂吸附芳香新塔花提取液中的黃酮類物質(zhì)，以樹脂對(duì)芳香新塔花總黃酮的吸附量和解吸率為指標(biāo)，考察了不同吸附濃度、吸附速度、吸附時(shí)間和乙醇濃度的影響，為更好地分離純化新塔花總黃酮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；大孔樹脂型號(hào)為型號(hào)為：XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300以及HPD-20：滄州恩寶化工有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

芳香新塔花藥材采自新疆昌吉州木壘縣龍王廟水庫，經(jīng)鑒定為唇形科新塔花屬植物（Z.clinopodioidesLam.）的干燥地上部分。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary-100型紫外-可見光分光光度計(jì)：美國瓦里安公司；VIC-412型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SB-2000恒溫水浴鍋、CA-1111冷卻水循環(huán)裝置：上海愛朗儀器廠；SK2200LH超聲儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

1.3 RE-5220方法

以總黃酮的吸附率和解吸率為指標(biāo)，用8種不同的大孔樹脂對(duì)芳香新塔花總黃酮進(jìn)行靜態(tài)吸附與解吸。篩選出8種大孔樹脂中吸附量最大，解吸量最大的大孔樹脂。在此基礎(chǔ)上對(duì)總黃酮純化的上樣濃度，大孔樹脂梯度洗脫，徑高比，上樣液流速的影響進(jìn)行研究。

1.3.1 樣品溶液的制備

總黃酮的提?。簩?duì)200g芳香新塔花采用回流法，提取溫度為80℃、乙醇濃度為75%vol、提取時(shí)間為65min、提取次數(shù)為2次、料液比為1∶20進(jìn)行總黃酮的提取，提取液濃縮至黏稠狀，烘干，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用AlCl3比色法[13-14]。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品63.25mg于250mL容量瓶中，用70%vol乙醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為158μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.00mL、1.50mL、3.00mL、4.50mL、6.00mL、7.50mL分別置于25mL容量瓶中，加入5%Na2NO20.75mL，搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.75mL，搖勻，放置6min，加入4%NaOH 10mL，加70%vol乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min，于波長510nm處測(cè)定其吸光度值，（標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法）以濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.0158X-0.0125，相關(guān)系數(shù)r=0.9993（n=9），結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液在0.53μg/mL～63.78μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

樣品溶液的配制：精密稱取0.94g芳香新塔花總黃酮，溶解于200mL水中，配制成溶液，備用。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

用95%vol乙醇將樹脂浸泡24h，使其充分溶脹，95%vol乙醇濕法裝柱，然后用95%vol乙醇以0.33mL/min通過樹脂柱，流出液與少量蒸餾水（1∶5）混合后至無白色渾濁為止；再用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味；接著用5%HCl溶液以0.33mL/min通過樹脂柱，并浸泡4h，用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的pH值呈中性；最后用2%NaOH溶液以0.33mL/min通過樹脂柱，并浸泡4h，用蒸餾水以同樣流速洗至流出液的pH值呈中性；浸泡于蒸餾水中，備用。

1.3.3 芳香新塔花中總黃酮對(duì)各種不同大孔樹脂的吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：稱取經(jīng)過預(yù)處理的8種不同的大孔樹脂各2g，置于錐形瓶中，分別加入樣品溶液30mL于錐形瓶中。每隔20min搖晃1次，搖晃2h，然后靜置24h，按照“1.3.1”方法配制蘆丁對(duì)照液，測(cè)量每個(gè)溶液的吸光度值，用以下公式計(jì)算其吸附量、解吸量、吸附率及解吸率。

式中：C0為樣液中總黃酮初始質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后濾液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；W為樹脂濕質(zhì)量，g；C2為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL。

靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)：將已經(jīng)用總黃酮浸泡過的大孔樹脂過濾，過濾出來的大孔樹脂分別依次放入原來已經(jīng)編號(hào)的錐形瓶中，各個(gè)錐形瓶中加入30mL、70%vol的溶液，浸泡，每隔20min搖動(dòng)1次，連續(xù)2h，然后靜置24h。按照“1.3.1”方法配制蘆丁對(duì)照液。

1.3.4 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹脂影響因素的考察

稱取6份經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂各10g（干質(zhì)量）濕法裝于各層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，量取6份質(zhì)量濃度為9.20mg/mL的樣液各20mL，分別加入0mL、20mL、40mL、60mL、80mL、100mL蒸餾水稀釋，使樣品盡可能混合均勻充分溶解。上柱，控制流速為0.5mL/min，測(cè)定流出液總黃酮含量，計(jì)算吸附量及吸附率，選擇適宜的上樣濃度。

1.3.5 大孔樹脂的梯度洗脫

稱取10g經(jīng)過預(yù)處理的HPD-600大孔樹脂濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中。量取濃度為4.70mg/mL的供樣液0.33mL/min上樣，控制流速為0.5mL/min，分別用蒸餾水、30%vol乙醇溶液、50%vol乙醇溶液、70%vol乙醇溶液、90%vol乙醇溶液梯度洗脫，每種溶液流速分別為0.33mL/min，分別收集各種洗脫液，按照“1.3.1”方法，測(cè)定每種溶液的吸光度值，計(jì)算每種溶液的解吸量和解吸率。

1.3.6 徑高比對(duì)大孔樹脂吸附總黃酮影響因素的考察

稱取4份處理好的HPD-600型大孔樹脂濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，使4個(gè)層析柱中徑高比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。分別在4個(gè)層析柱中加入樣品溶液125mL、100mL、75mL、50mL，控制流速為0.33mL/min，按照“1.3.1”方法配制蘆丁對(duì)照液，測(cè)定每種溶液的吸光度值，算出流出液的總黃酮含量，計(jì)算吸附率。

1.3.7 上樣液流速對(duì)大孔樹脂吸附總黃酮的影響因素的考察

用濕法裝柱（Φ1.5cm×40cm），將等量稱取的5份預(yù)處理好的大孔樹脂HPD-600按照徑高比為1∶10分別裝在5個(gè)層析柱中，精密量取5份蘆丁對(duì)照液100mL，分別控制上樣液體流速為0.17mL/min、0.33mL/min、0.5mL/min、0.67mL/min、0.83mL/min，按照總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算每種溶液的吸附量。

1.3.8 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線考察

將預(yù)處理好的HPD-600型號(hào)的大孔樹脂用濕法裝柱于層析柱（Φ1.5cm×40cm）中，加入蘆丁對(duì)照液，上樣液流速控制在0.5mL/min，徑高比為1∶10，每0.17mL/min收集一次。共收集18份。測(cè)定每份洗脫液總黃酮含量。

1.3.9 樹脂的強(qiáng)化再生方法

樹脂使用一定的周期后，吸附能力會(huì)有所下降，尤其當(dāng)被污染已經(jīng)很嚴(yán)重的時(shí)候，吸附能力降低較大的時(shí)候需要強(qiáng)化再生。其方法是，在容器中加入高于樹脂層10cm的2%～3%的鹽酸溶液浸泡2h～4h，然后用鹽酸溶液0.5mL/min過柱子，并用蒸餾水洗至中性；繼續(xù)用5%的氫氧化鈉溶液浸泡至2h～4h，并同時(shí)用同濃度的氫氧化鈉溶液0.5mL/min過柱子，最后再用蒸餾水清洗至中性，再用乙醇0.33mL/min～0.5mL/min過柱子，然后用蒸餾水洗去乙醇，用蒸餾水浸泡備用[15]。也可以加入部分新樹脂補(bǔ)充再生損耗或者新舊樹脂套用。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸測(cè)定結(jié)果

圖1 各型大孔樹脂對(duì)芳香新塔花總黃酮的吸附量與解吸量Fig.1 Adsorption and desorption capacity of different types of macroporous resins for total flavonoids from Ziziphora clinopodioidesLam

由圖1可知，D-101型和DM-130雖然解吸率比較大，但是其吸附率不高。XAD-7HP、HPD-20、AB-8、HPD-300、X-5的吸附率和解吸率均不好。因此HPD-600型號(hào)的大孔樹脂為這8種中的最佳選擇。

2.2 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)HPD-600型大孔樹脂吸附總黃酮的影響的結(jié)果

圖2 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)HPD-600型大孔樹脂吸附總黃酮的影響Fig.2 Effect of sample loading concentration on adsorption rates of HPD-600 macroporous resin for total flavonoids

由圖2可知，進(jìn)樣質(zhì)量濃度不能過大也不能過小，質(zhì)量濃度過大或過小都不利于大孔樹脂對(duì)芳香新塔花總黃酮的吸附，濃度過大，會(huì)造成總黃酮的浪費(fèi)，使其吸收不完全；質(zhì)量濃度過小，大孔樹脂不能充分利用。因此，質(zhì)量濃度為4.70mg/mL的進(jìn)樣液比較適宜。

2.3 洗脫液濃度考察結(jié)果

表1 洗脫液濃度考察Table 1 Determination of eluent concentration

由表1可知，總黃酮主要集中在30%vol、50%vol和70%vol的乙醇溶液中，因此，可以把30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脫液合并利用?？傸S酮分布于不同濃度的乙醇溶液中，原因是黃酮中帶有不同的基團(tuán)，因而極性不同，不同極性的黃酮由不同濃度的乙醇溶液洗脫而出，因而總黃酮分布于不同濃度的溶液中。

2.4 徑高比對(duì)吸附量的影響結(jié)果

由圖3可知，隨著徑高比的增加，大孔樹脂吸附總黃酮能力也在增加。徑高比為1∶10的時(shí)候，大孔樹脂對(duì)總黃酮的吸附較好。因此，徑高比確定為1∶10。

2.5 進(jìn)樣流率對(duì)HPD-600型大孔樹脂吸附的影響結(jié)果

由圖4可知，HPD-600型大孔樹脂對(duì)總黃酮的吸附量隨進(jìn)樣流速的增加也逐漸增加，當(dāng)進(jìn)樣流速增加到一定程度時(shí)，吸附量反而會(huì)下降。因?yàn)楫?dāng)流速過大的時(shí)候，進(jìn)樣液和大孔樹脂接觸時(shí)間減少，吸附不夠充分，吸附量也會(huì)隨著進(jìn)樣流速的增加而降低，所以上樣液的流速不能過大，也不能過小，因此，上樣液流蘇控制在0.5mL/min。

圖3 徑高比對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of diameter height ratio on the adsorption rate

圖4 進(jìn)樣流速對(duì)HPD-600型大孔樹脂吸附的影響Fig.4 Effect of sample loading flow rate on adsorption of HPD-600 macroporous resin

2.6 HPD-600型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線

圖5 HPD-600型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線Fig.5 Leakage curve for the dynamic adsorption of HPD-600 macroporous resin

由圖5可知，開始洗脫時(shí)，洗脫液中的總黃酮含量是隨著洗脫體積的增加而提高，當(dāng)洗脫到第16份總黃酮流出液后，流出液的總黃酮含量增加趨于平穩(wěn)，達(dá)到上樣液的濃度，結(jié)果表明大孔樹脂的吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，最大的上樣量為2.67mL/min。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)8種不同型號(hào)的大孔樹脂的吸附與解吸性能進(jìn)行比較，結(jié)果表明，HPD-600型號(hào)的大孔樹脂是最適用于純化芳香新塔花總黃酮成分的樹脂。同時(shí)采用HPD-600型號(hào)大孔樹脂柱層析純化芳香新塔花總黃酮最佳條件為上樣液濃度為4.70mg/mL，徑高比為1∶10，上樣液流速為0.5mL/min，洗脫時(shí)合并30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脫液。

研究可以發(fā)現(xiàn)，上樣液體的濃度不宜過大，但是也不能過小。過大造成總黃酮溶解不充分，造成有效成分浪費(fèi)，而且總黃酮會(huì)沉淀在大孔樹脂上，降低樹脂的使用壽命，流速也會(huì)越來越慢，得不到控制，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有很大的影響。濃度過小，大孔樹脂不能充分利用。在選用洗脫液濃度（乙醇濃度）的時(shí)候，乙醇濃度也不能過大，過大不能對(duì)吸附在大孔樹脂上所吸附的總黃酮進(jìn)行洗脫，并且對(duì)乙醇也會(huì)造成浪費(fèi)。在上樣流速的測(cè)定時(shí)，上樣流速不能太快，流速太快，上樣液和大孔樹脂接觸時(shí)間不夠，大孔樹脂對(duì)溶液中的芳香新塔花總黃酮吸附不夠充分，吸附量也會(huì)隨著流速的增加而降低。因此，也要控制好上樣液的流速。

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