和占星，亐開興，2，張繼才，王安奎，金顯棟，楊國榮，昝林森，黃必志＊

（1.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，云南 昆明 650212；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100）

BMY牛較為廣泛地適應(yīng)于我省濕熱地區(qū)，與云南黃牛及其他雜交組合能獲得較好的雜種優(yōu)勢［1］，BMY牛以其自身的優(yōu)良特性而備受云南省地州肉牛養(yǎng)殖戶的青睞。檢測BMY牛的肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因多態(tài)性，通過候選基因研究肌肉細(xì)胞分化和發(fā)育的重要功能基因的分子生物學(xué)機(jī)制［2－5］，探索抑制肌生成抑制素活性而增加肌肉量的方法，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值，肌生成抑制素研究的突破將對豬、肉雞、肉牛等畜禽生產(chǎn)性能的提高具有重要意義［3，6，7］。尋找畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的連鎖標(biāo)記，候選基因法是非常有效的，它可以更直接地研究基因的多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系［3，6，7］。

另外，MSTN在肌肉的生長發(fā)育中起著極其重要的作用，牛的MSTN基因是影響肉用性狀的重要候選基因之一。通過探索BMY牛的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為以后BMY牛的肉用性狀研究提供一定的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也希望能夠?qū)ζ帕_門牛、云南黃牛及大額牛等開展更多的分子生物學(xué)工作和標(biāo)記輔助選擇相關(guān)研究起到拋磚引玉的初衷。

1 材料與方法

1.1 PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)材料為BMY牛（R5263）總DNA。根據(jù)GenBank中牛的 MSTN全序列（登錄號：AB076403）［7］設(shè)計(jì)exon 2 引物，F(xiàn)orward：5′－GTTCATAGATTGATATGGAGGTGTTCG－3′ 和Reverse：5′－ATAAGCACAGG AAACTGGTAG TTATT－3′。PCR反應(yīng)體系為：按50μL準(zhǔn)備，含10×Buffer 5μL，25mmol／L MgCl21.5μL，2.5 mmol／L dNTP 2μL，10pmol／μL上、下游引物各1 μL，5U／μL Taq酶0.3μL，DNA模板20～50ng，以滅菌水補(bǔ)足剩余體積。然后以25μL／管反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1min，52℃退火40s，72℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min；4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測，2%瓊脂糖凝膠回收，PCR產(chǎn)物回收時(shí)做割膠回收（按上海華舜生物技術(shù)有限公司回收試劑盒說明書操作）。

1.2 克隆測序

1.2.1 將回收的PCR產(chǎn)物檢測 加樣量跟DL 2 000Marker相比，目的產(chǎn)物～400bp，與 Marker亮度相同的加3μL回收產(chǎn)物，比Marker亮的加2.5 μL。

1.2.2 連接 溶液Ⅰ加2.5μL，載體0.5μL，模板量按步驟1加，吸打混勻，瞬時(shí)離心，16℃連接過夜。

1.2.3 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解 取50μL的感受態(tài)細(xì)胞直接加入到連接產(chǎn)物中，用移液器慢慢吸打混勻，然后置冰上30min。準(zhǔn)備工作：①把水浴鍋調(diào)至42℃；②準(zhǔn)備復(fù)蘇培養(yǎng)基；③開啟搖床電源，調(diào)節(jié)溫度至37℃。

1.2.4 調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱至37℃ 再把加入了感受態(tài)細(xì)胞的連接產(chǎn)物放42℃水浴90s，立即置冰上5 min。然后再全部轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇培養(yǎng)基中，在搖床上以200r／min 37℃培養(yǎng)1～2h。

1.2.5 涂板 每管取150～200μL加到事先準(zhǔn)備好的平板上，用1.5mL EP管涂勻，放置37℃30 min，之后把培養(yǎng)平板倒置培養(yǎng)11～13h。

1.2.6 按菌落PCR法進(jìn)行擴(kuò)增 檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列核對經(jīng)DNAStar 6.0軟件進(jìn)行人工校對，同源性比較經(jīng)DNAman 5.2.9比對，N－J樹（Neighbor－Joining tree，N－J tree）由 MEGA 4.1軟件構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和測序

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得片段約400 bp，與預(yù)期片段大小相吻合?；贓nsembl（http：／／www.ensembl.org／index.html）參考了普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）等哺乳動(dòng)物的MSTN基因exon 2，界定了BMY牛與大額牛的MSTN 基因exon 2為372bp。BMY 牛（R5263）MSTN 基因exon 2序列（1－372）：

BMY牛MSTN基因exon 2的堿基組成A、T、G、C分別為33.0%、24.2%、21.8%和21.0%，大額牛079－gayal的分別為 33.3%、24.2%、21.5% 和21.0%，差異不大。牛亞科物種中，MSTN基因exon 2很保守（圖1），第39、46、84及266位存在多態(tài)性，前三個(gè)位點(diǎn)均為同義突變，第266位為錯(cuò)義突變，造成了日本和牛（Japanese Black cattle，JBC）第89位氨基酸由 Asn（N）變?yōu)镾er（S）（圖2）。

2.2 BMY牛MSTN基因exon 2編碼的核苷酸同源性比較

經(jīng)過DNAman 5.2.9軟件比較幾個(gè)物種的核苷酸同源性（表1），牛亞科物種之間的同源性在98.7%～100.0%之間；牛亞科物種與其他哺乳動(dòng)物的同源性稍低，與人猿超科的同源性在94.1%～95.4%之間，與小鼠和狗的同源性更低，與家雞的同源性僅在85.5%～85.8%。

圖1 12個(gè)物種MSTN基因exon 2的核苷酸變異

表1 12個(gè)物種MSTN基因exon 2的核苷酸序列同源性比較

2.3 幾個(gè)物種MSTN基因exon 2編碼的氨基酸變異

經(jīng)過 MEGA 4.1軟件ClusterW比對，翻譯得到對應(yīng)的124個(gè)氨基酸殘基見圖2。由圖2可看出，BMY牛、瘤牛、牦牛與大額牛079－gayal的氨基酸序列一致，與日本和牛不同的是第89位氨基酸發(fā)生了天冬酰胺（Asn）→Ser絲氨酸（Ser）的突變。同時(shí)，還可看出人猿超科物種的特異性，如第39位的谷氨酸（Glu）；而家雞的序列變異與哺乳動(dòng)物之間差異很大。

2.4 基于牛MSTN基因exon 2的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

通過Mega 4.1構(gòu)建了以家雞為外群的幾種哺乳動(dòng)物之間的N－J系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3），可見11種哺乳動(dòng)物與家雞明顯分開，牛亞科物種中的牦牛、大額牛、日本和牛、瘤牛與BMY牛聚為一支，而人與黑猩猩、獼猴聚為一支，兩支的支持率較高（99%）。

從圖2還可看出，具有明顯大額牛體型特征的個(gè)體079－gayal（Bos frontalis）與瘤牛（zebu，Bos indicus）關(guān)系更近，推測大額牛在其形成歷史中曾經(jīng)受過家養(yǎng)牛的基因漸滲現(xiàn)象［8－10］。BMY牛培育中含有50%婆羅門牛血統(tǒng)，與包括日本和牛的牛亞科物種聚為一支，由于相互關(guān)系較近，這一支的支持率較低（不到50%），但與水牛的關(guān)系非常明朗，關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 12個(gè)物種MSTN基因exon 2的氨基酸變異

3 討論

經(jīng)過了近30年的選育，BMY牛已形成了遺傳性能穩(wěn)定的新品種（系），適宜于我國南方熱帶亞熱帶地區(qū)，抗蜱性強(qiáng)，具有抗血液原蟲病的能力。BMY牛初生重公犢31kg，母犢29kg，36月齡體重公牛620kg以上，母牛400kg以上。母牛初情期8～10月齡，初配年齡12月齡或體重在250kg以上，發(fā)情周期為21d（17～23d），發(fā)情持續(xù)時(shí)間為12～27h，妊娠期為282d。在常規(guī)飼養(yǎng)條件下，BMY牛的泌乳期為245～305d，產(chǎn)乳量為752.2±133.2 kg。公牛18月齡或體重在300kg以上可配種或采精［11］。在維持飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)170%的條件下，12～24月齡日增重公牛1.1kg、母牛0.9kg，24月齡屠宰率公牛63%、母牛59%，凈肉率公牛54%、母牛51%，眼肌面積公牛85cm2、母牛70cm2。肉質(zhì)細(xì)嫩、多汁，大理石紋明顯。公牛的BPI為5.4±0.5，母牛為4.0±0.3［12］。鑒于 BMY 牛的產(chǎn)肉性能及肉質(zhì)特性，選擇與產(chǎn)肉性狀相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，無疑具有重要的理論意義。

BMY牛MSTN基因exon 2與牛亞科物種的同源性很高，在98.7%～100.0%之間，與其他哺乳動(dòng)物的同源性稍低（92.7%～95.4%），與家雞的同源性不到90.0%。同時(shí)由N－J分子進(jìn)化樹可看出，BMY牛、大額牛與瘤牛的關(guān)系最近，表明二者受瘤牛的影響較大，且BMY牛垂皮較發(fā)達(dá)，公牛具有明顯的肩峰；同時(shí)與日本和牛、牦牛的關(guān)系也較近，與水牛的關(guān)系遠(yuǎn)。與其他哺乳動(dòng)物的關(guān)系明顯分化，與其他核基因如乳蛋白基因、溶菌酶基因等所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹所揭示的結(jié)論相一致［7，13，14］。

圖3 基于MSTNexon 2構(gòu)建的12個(gè)物種的N－J系統(tǒng)發(fā)生樹

本研究為BMY牛的分子標(biāo)記奠定了一些基礎(chǔ)性工作，至于MSTN基因與BMY牛經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)增加大額牛的樣本量檢測，從多個(gè)角度全面地揭示其遺傳組成。

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