袁果園 王云帆 熊偉

(重慶科技學院安全工程學院，重慶 401331)

我國每年抗生素原料產(chǎn)量約為21萬t，其中有9.7 萬 t用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［1］。王云鵬等人［2］對國內(nèi)5省市進行的養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用情況調(diào)查表明飼養(yǎng)場濫用抗生素現(xiàn)象相當嚴重。雖然使用抗生素有可能降低養(yǎng)殖成本，但長期使用抗生素可誘導耐藥菌的出現(xiàn)［3］。在肉制品中，抗生素殘留量不是很大，但人們長期食用后，可在體內(nèi)大量蓄積，給人體健康帶來危害［4］。在污水處理廠和廢水中，已檢測出耐藥性和多種耐藥性細菌，這些細菌很可能通過污水灌溉、污泥施肥等方式進入食物鏈［5］。殘留在飲用水中的抗生素，長期飲用將降低人體免疫力［6］。部分藥物有致癌、致突變等作用，嚴重干擾了人體各項生理功能［7］。

抗生素中β－內(nèi)酰胺類是一種種類繁多的抗生素，包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素等。此類抗生素因殺菌活性強、毒性低、適應癥廣及臨床療效好等優(yōu)點而被廣泛應用于治療和預防各種疾病。隨著人們生活和衛(wèi)生水平的不斷提高以及β－內(nèi)酰胺類抗生素逐漸成為抗菌的重點藥物，β－內(nèi)酰胺類的需求量將繼續(xù)增長，這將給國內(nèi)的β－內(nèi)酰胺類酰胺類抗生素產(chǎn)品提供更為廣闊的市場，且在今后相當長的時期內(nèi)，仍是抗生素發(fā)展的主流。因此，研究一種快速精確檢測食品和環(huán)境中多種抗生素殘留的方法是非常必要的。常用的TTC檢測法［8］和紙片檢測法［9］的精密度和準確度不高，且易受其他抗菌藥物的干擾;免疫分析法［10］和試劑盒法［11］的檢測時間較長，樣品前處理較復雜，同時也很難進行現(xiàn)場檢測;化學發(fā)光法［12］和熒光分光光度法［13］的樣品預處理復雜，流程繁瑣，設備昂貴，需要專業(yè)技術人員等，很難實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和推廣。

HPLC是在經(jīng)典液相色譜的基礎上，采用了由全多孔或非多孔高效微粒固定相制備的色譜柱，有高壓輸液泵輸送流動相，用高靈敏度檢測器進行檢測，實現(xiàn)了高柱效、高選擇性、高靈敏度的快速分析，并成為有機物定量分析的主要分析工具。本文以β－內(nèi)酰胺類藥物——青霉素鈉和頭孢他啶為樣本，通過優(yōu)化HPLC的檢測條件，來實現(xiàn)快速、準確的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Science高效液相色譜系統(tǒng)，包括P680高壓梯度溶劑輸送泵，AD25紫外—可見檢測器和LC20柱溫箱;Ultimate XB－C18色譜柱(4.6 mm×250 mm Column 5－Micron);超純水系統(tǒng);針筒式微孔濾膜過濾器(天津騰達過濾器件廠);450 nm微孔濾膜(上海新亞有限責任公司);數(shù)控超聲波清洗器(南京壘君達超聲電子設備有限公司);PHS－3C型實驗室PH計(榮慶計量檢測儀器有限公司);砂芯過濾裝置(天津市領航實驗設備有限公司);真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

甲醇，色譜純(成都市科龍化工試劑廠);磷酸，色譜純(天津光復精細化工研究所)。

1.2 溶液的配制

準確稱取0.025 g青霉素鈉和頭孢他啶，于25 mL容量瓶中，加入10 mL超純水，搖勻，待完全溶解，冷卻后，用超純水定容至刻度，并搖勻，配制成濃度為1 mgmL的青霉素鈉和頭孢他啶標準儲備液，密封，4℃冷藏保存。

取480 mL超純水于燒杯中，加入2 mL磷酸，搖勻，用過濾器過濾，濾膜是450 nm微孔濾膜，得到流動相A。

1.3 色譜條件

流動相A為水磷酸溶液;流動相B為甲醇。流速為1 mLmin，進樣量為 10 μL，柱溫為 25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相組成配比的優(yōu)化

青霉素鈉流動相組成配比中甲醇分別為30%、35%、40%的色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。出峰時間分別為8.507、7.242、5.560 min。在多種成分的檢測中，應盡量使出峰在溶劑峰之后，取保留時間較短為好，因此甲醇為30%時為最優(yōu)流動相配比。

圖1 青霉素鈉流動相組成配比中甲醇為30%的色譜圖(出峰時間為6.8 min)

圖2 青霉素鈉流動相組成配比中甲醇為35%的色譜圖(出峰時間為4.2 min)

圖3 青霉素鈉流動相組成配比中甲醇為40%的色譜圖(出峰時間為8.0 min)

頭孢他啶流動相組成配比中甲醇分別為25%、30%、35%的色譜圖分別見圖4、圖5、圖6。出峰時間分別為5.012、3.900、3.333 min，因此甲醇為25%時為最優(yōu)流動相配比。

圖4 頭孢他啶流動相組成配比中甲醇為25%的色譜圖(出峰時間為4.6 min)

圖5 頭孢他啶流動相組成配比中甲醇為30%的色譜圖(出峰時間為3.7 min)

圖6 頭孢他啶流動相組成配比中甲醇為35%的色譜圖(出峰時間為3.2 min)

2.2 檢測波長的優(yōu)化

不同波長下檢測得到的青霉素鈉和頭孢他啶的液相圖譜峰面積見表1。在282 nm時青霉素鈉的色譜峰面積最大，出峰最明顯，因此282 nm為最佳檢測波長。在260 nm時頭孢他啶的色譜峰面積最大，出峰最明顯，因此260 nm為最佳檢測波長。

2.3 線性關系、檢出限和重復性

實驗結(jié)果表明，在10～1000 ngmL濃度范圍內(nèi)，線性關系R2均大于0.990。采用3倍信噪比計算檢出限，其中青霉素鈉和頭孢他啶檢出限分別是3.5 ngmL 和6.5 ngmL。采用 10 倍信噪比計算定量下線，結(jié)果見表2。配制10 ngmL和25 ngmL標準溶液，分別連續(xù)進樣4次，峰面積相對標準偏差(RSD)均小于2%，重現(xiàn)性較好。

表1 青霉素鈉和頭孢他啶在不同波長下的峰面積

2.4 實際樣品的測定

圖7和圖8分別為市售某廠家生產(chǎn)的青霉素鈉和頭孢他啶成品藥在優(yōu)化條件下濃度為1 mgmL的檢測圖譜。

表2 抗生素校正曲線回歸分析、檢出限和定量下限

圖7 成品青霉素鈉的檢測圖譜

圖8 成品頭孢他啶的檢測圖譜

圖7、圖8表明在該條件下能夠檢測出2種物質(zhì)。峰面積分別為830和1151，通過計算，該成品藥青霉素鈉和頭孢他啶的有效濃度分別為29 ngmg和16 ngmg，因此，成品藥青霉素鈉和頭孢他啶的有效含量分別為2.9%和1.6%。

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