余遠(yuǎn)迪，曾 澤，岳 華，張 斌

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是普通豬上呼吸道的一種共棲菌，能在特定條件下侵入機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。主要臨診癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟(jì)失調(diào)和被毛粗亂等，剖檢病理變化表現(xiàn)為胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等；主要危害2周齡～8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為10%～15%，病死率可達(dá)50%以上［1－2］。豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）是豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）的致病菌，以急性出血和慢性纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣?，慢性癥狀表現(xiàn)為可造成豬生長(zhǎng)緩慢的肺損傷，給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［3］。在臨床診斷中，很難通過(guò)臨床癥狀和病理特征鑒別這兩種疾病的混合感染。而傳統(tǒng)的鑒別診斷方法，即病原分離和血清學(xué)診斷，由于敏感性和特異性不高，不能滿(mǎn)足快速鑒別診斷的需要，所以建立一種快速準(zhǔn)確的病原檢測(cè)方法尤為重要。多重PCR作為一種特殊的PCR比單項(xiàng)PCR更加快捷和簡(jiǎn)便，已應(yīng)用于診斷多種疾病的混合感染［4－6］。本 試 驗(yàn) 根 據(jù) Hps 16SrRNA 序 列 和 App ApxIVA基因序列各設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)特異性和敏感性試驗(yàn)，建立了可快速鑒別檢測(cè)副豬嗜血桿菌和豬傳染性胸膜放線桿菌的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與毒株 Hps菌株參考血清1型（HS82）、2型（HS83）、3型（HS81）、4型（HS79）、5型（HS80）、6 型 （HS1072）、7 型 （HS1073）、8 型（HS1073）、9 型 （HS50）、10 型 （HS1076）、11 型（HS1077）、12 型 （HS1075）、13型 （HS1079）、14 型（HS1080）、15型（HS1081）、100株 Hps臨床分離株（SWUN050～SWUN151），App參考菌株血清1型（CVCC259）、血 清 2 型 （CVCC260）、血 清 3 型（CVCC261）、血 清 4 型 （CVCC262）、血 清 5 型（CVCC263）、血 清 6 型 （CVCC264）、血 清 7 型（CVCC265）、血 清 8 型 （CVCC266）、血 清 9 型（CVCC267）、血 清 10 型 （CVCC268）、血 清 11 型（CVCC269）、血清12型（CVCC270），15株 App臨床分離株（SWUN170～SWUN182），支氣管敗血波氏桿菌（SWUN200）、豬源多殺性巴氏桿菌（SWUN201）、豬源大腸埃希菌（SWUN203）、豬源沙門(mén)菌（SWUN204）、豬源金黃色葡萄球菌（SWUN205）、豬圓環(huán)病毒2型（SWUN061）、豬流感病毒（H1N1）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（疫苗株）、大腸埃希菌JM109菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存（表1）。

1.1.2 主要試劑及試劑盒 胰蛋白酶胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）為青島海博生物有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為Sigma公司產(chǎn)品；MgCl2、dNTP、r Taq聚合酶和pMD19－T Vector等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒為Omega生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)［7］根據(jù) Hps 16SrRNA序列設(shè)計(jì)引物，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為822bp，引物序列 為，PH1：5′ GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3′；PH2：5′GGCTTCGTCACCCTCTGT3′。參照文獻(xiàn)［8］根據(jù)App ApxIVA基因設(shè)計(jì)引物，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為346bp，引物序列為，PA1：5′ATACGGTTAATGGCGGTAATGG3′；PA2：5′ACCTGAGTGCTCACCAACG3′。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Hps與App的培養(yǎng) 將參考菌株 Hps和App分別接種于含有50mL／L小牛血清和0.1 mL／L的NAD的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24h～48 h，單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，觀察結(jié)果，保存?zhèn)溆?；從TSA平板上挑取單菌落培養(yǎng)于50mL／L小牛血清和0.1mL／L的NAD的TSB培養(yǎng)基中，置于37℃，150r／min振搖培養(yǎng)24h。

1.2.2 DNA模板的制備 細(xì)菌DNA模板制備：按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；組織中DNA的提?。喊唇M織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品采用25μL反應(yīng)體系：DNA模板1μL，上游引物1 μL，下游引物1μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）2μL，MgCl21.5μL，rTaq1U，無(wú)菌雙蒸水15.8μL。以下反應(yīng)條件分別擴(kuò)增Hps 16S rRNA片段和App ApxIVA片段：94℃5min；94℃30s，58℃40s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，16℃反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，小量膠回收試劑盒回收目的片段，分別連接pMD19－T Vector，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性質(zhì)粒用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定OD 260nm值，計(jì)算其濃度，將兩種陽(yáng)性質(zhì)粒調(diào)整至相同濃度，等量混合，即為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 雙重PCR方法的建立 以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在Hps、App單項(xiàng)PCR穩(wěn)定的基礎(chǔ)以25μL總體積，優(yōu)化反應(yīng)體系。對(duì)退火溫度（52℃～62℃）進(jìn)行優(yōu)化，再以?xún)?yōu)化的退火溫度對(duì)兩對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，以電泳條帶最亮，無(wú)非特異擴(kuò)增，引物二聚體最少，敏感性最高為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 雙重PCR特異性試驗(yàn) 以相同條件擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)保存的波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組模板，檢測(cè)該雙重PCR方法的特異性。

1.2.6 多重PCR的敏感性試驗(yàn) 分別用單項(xiàng)和雙重PCR檢測(cè)10倍系列稀釋陽(yáng)性模板，初始模板濃度為3.8μg／mL，模板稀釋6個(gè)梯度，為10－1～10－6。將Hps和App純培養(yǎng)后，用PBS將細(xì)菌洗下，細(xì)菌計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)菌濃度，用PBS將其從10－1～10－6進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)魅?μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 多重PCR的通用性試驗(yàn) 用Hps 15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清型參考株，100株Hps臨床分離株和12株App標(biāo)準(zhǔn)血清型參考株，15株App臨床分離株進(jìn)行通用性檢測(cè)。

1.2.8 臨床樣本的檢測(cè) 對(duì)36份臨床采集的疑似樣本從肺臟細(xì)支氣管進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)，并從肺臟組織中提取組織DNA，用單項(xiàng)PCR方法及本研究所建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 人工感染樣本的檢測(cè) 人工感染試驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將10頭1月齡仔豬隨機(jī)分為2組飼養(yǎng)，第一組5頭仔豬用濃度為1×109cfu的 Hps標(biāo)準(zhǔn)血清5型菌株氣管注射，接種劑量5mL／頭；第二組5頭仔豬用濃度為1×109cfu的App標(biāo)準(zhǔn)血清5型菌株氣管注射，接種劑量為5mL／頭。注射后每隔1h觀察仔豬臨床癥狀，處死發(fā)病癥狀明顯的仔豬，分別采集其肺組織，用所建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 單項(xiàng)及多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用引物 PH1、PH2、PA1、PA2按文中1.2.3的方法分別擴(kuò)增Hps和App的DNA模板，結(jié)果只擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段；同時(shí)以Hps和App的DNA為模板時(shí)，結(jié)果擴(kuò)增出Hps16SrRNA 822bp和App ApxIVA 346bp 2個(gè)片段。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明所擴(kuò)增的片段為Hps和App目的基因片段（圖1）。

2.2 雙重PCR條件的優(yōu)化

采用25μL反應(yīng)體系，最佳退火溫度為60℃，Hps和 App引物的最佳配比 0.6μmol／L∶1μmol／L（圖2和圖3）。

圖1 Hps和App基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of Hps and App genes

圖2 雙重PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of annealing temperature in duplex PCR

圖3 雙重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of primer concentration in duplex PCR

2.3 雙重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果表明，多重PCR方法可特異性地?cái)U(kuò)增Hps和App目的片段，不與豬源波氏桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌、豬源大腸埃希菌、豬源沙門(mén)菌、豬源金黃色葡萄球菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明該方法具有較高的特異性（表1）。

表1 雙重PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of specificity tests of duplex PCR

2.4 雙重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 最低檢測(cè)核酸濃度 該方法對(duì)Hps和App重組質(zhì)粒DNA濃度的最低檢測(cè)核酸濃度Hps 38 pg／mL，App 3.8pg／mL，與單項(xiàng)PCR檢測(cè)靈敏度基本相符（圖4）。

2.4.2 最低檢測(cè)細(xì)菌含量 雙重PCR方法對(duì)Hps和App最低檢測(cè)細(xì)菌含量 Hps 8.9cfu，App 26.9 cfu，與單項(xiàng)PCR檢測(cè)靈敏度基本相符（圖5）。

2.5 通用性檢測(cè)結(jié)果

該方法對(duì)Hps 15個(gè)血清型參考菌株，100株Hps臨床分離株，App 12個(gè)血清型參考菌株和15株App臨床分離株的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法能對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株全部檢出，表明該方法具有較好的通用性。

2.6 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)36份臨床采集的疑似病料分別進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR檢測(cè)，常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)檢出Hps 13份，檢出率為36.11%；雙重PCR檢測(cè)出Hps 18份，檢出率為50%，未檢出App；單項(xiàng)PCR檢測(cè)與雙重PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

2.7 人工感染樣本的檢測(cè)結(jié)果

在Hps人工感染試驗(yàn)中，肺臟組織用單項(xiàng)PCR和雙重PCR檢測(cè)，結(jié)果均為Hps陽(yáng)性；在App人工感染試驗(yàn)中，肺臟組織用單項(xiàng)PCR和雙重PCR檢測(cè)，結(jié)果均為App陽(yáng)性。

圖4 雙重PCR最低檢測(cè)核酸濃度Fig.4 Minimal detection concentration of nucleic acids in the duplex PCR

圖5 雙重PCR最低檢測(cè)細(xì)菌含量Fig.5 Minimal detection of cfu in duplex PCR

3 討論

Hps和App是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌，而且兩種病原菌均為革蘭陰性菌，具有多形性，生長(zhǎng)條件要求嚴(yán)格，難于培養(yǎng)和分離，給診斷和治療帶來(lái)一定的困難，因此需要建立一種快速檢測(cè)方法。多重PCR檢測(cè)技術(shù)是一種快速、特異、敏感和可靠的病原檢測(cè)方法［4－6］。16SrRNA 基因普遍存在于細(xì)菌并參與細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，已成為細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的一個(gè)重要標(biāo)志，目前已經(jīng)建立了多種細(xì)菌基于16SrRNA 基因的分子診斷方法［9－10］。溶血素（Apx）為App毒力因子之一，屬于RTX毒素家族，ApxIVA由Schaller A等于1999年在App中首次發(fā)現(xiàn)，存在于所有血清型的放線桿菌中，具有種的特異性［11－12］。本研究參考已發(fā)表的針對(duì) Hps 16S rRNA引物及App ApxIVA設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增出822bp及346bp的目的片段，所建立的雙重PCR對(duì)其他細(xì)菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明建立的方法具有較好的特異性，最低可檢測(cè)核酸濃度Hps 38 pg／mL，App 3.8pg／mL；最低檢測(cè)細(xì)菌含量 Hps 8.9cfu，App26.9cfu，與單項(xiàng)PCR的敏感性一致。

該方法通用性研究表明，應(yīng)用該方法對(duì)Hps 15個(gè)血清型參考株，100株臨床分離株均能檢出；對(duì)App 12個(gè)血清型參考株，15株臨床分離株均能檢出，說(shuō)明該方法具有良好的通用性。對(duì)常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)及該雙重PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示該方法對(duì)Hps和App的檢出率明顯高于常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)；而且該方法特異性和敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效，可在5h內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果。因此，本研究建立的Hps和App雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)于Hps和App感染的快速診斷及病原的監(jiān)測(cè)等均具有很高的實(shí)用價(jià)值。

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