楊 磊，張建坡，王相國，許 勤，靳亞平，王愛華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

蛋白重組技術(shù)在傳染病的診斷以及作為亞單位疫苗方面有著廣泛的應(yīng)用。高水平的重組蛋白表達(dá)是蛋白提純以及其他應(yīng)用的先決條件。高產(chǎn)量和高純度的融合表達(dá)蛋白在生物化學(xué)、三維結(jié)構(gòu)、免疫反應(yīng)性和診療研究中有著廣泛而重要的意義［1］。純化的重組蛋白被用于多種傳染性疾病包括布魯菌病的診斷方法的研究。布魯菌病（Brucellosis）是由布魯菌（Brucella）感染引起的世界范圍的重要人畜共患傳染病之一，在我國屬于二類傳染病［2］。布魯菌是革蘭陰性、兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，主要通過黏膜上皮侵入機(jī)體，在脾臟、肝臟、乳腺、生殖器官等部位增殖和擴(kuò)散［3］。人類通過食用被感染動物的產(chǎn)品或直接接觸被感染動物而感染布魯菌病。布魯菌外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）暴露于細(xì)菌表面，在布魯菌不同種之間具有高度的保守性，動物感染后可以產(chǎn)生針對不同蛋白的特異性抗體，引起免疫性保護(hù)反應(yīng)［4］，布魯菌外膜蛋白16（Omp16）屬于第一組外膜蛋白，是一種免疫優(yōu)勢抗原和探測抗布魯菌抗體的重要靶分子，幾乎存在于所有已知的布魯菌種型中［5－7］。因此用布魯菌Omp16作為臨床血清學(xué)方法的檢測是非常可靠的，而這種方法的建立需要大量的布魯菌外膜重組蛋白Omp16。為了獲得布魯菌外膜重組蛋白Omp16，本研究將其連接于PET32－a原核表達(dá)載體，進(jìn)一步改良提純方法，最終提高了Omp16產(chǎn)量和純度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 布魯菌活疫苗株S2株，由陜西省獸藥監(jiān)察所惠贈；pET－32a質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物生物技術(shù)農(nóng)業(yè)部重點實驗室保存；大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物技術(shù)有限公司（天根公司）。

1.1.2 主要試劑 TaKaRa Taq、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ、dNTP、100bp DNA Ladder Marker均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的布魯菌Omp16的基因序列，設(shè)計一對特異性PCR引物，并在上、下游引物的5′端分別加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點。引物序列如下：

Omp16F：CCGGAATTCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG

Omp16R：ACGCGTCGACTTACCGTCCGGCCCCGTTGA

1.2.2 布魯菌基因組DNA的提取與目的基因的擴(kuò)增 從－70℃冰箱取出甘油保存的布魯菌，室溫融化，取50μL接種于5mL TSA液體培養(yǎng)基，37℃、200r／min振搖培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)物在TSA平板上畫線，37℃培養(yǎng)72h后，挑取單個菌落，接種5 mL TSA液體培養(yǎng)基，37℃ 振搖培養(yǎng)48h，高壓滅菌，離心收集菌體，用基因組提取試劑盒提取布魯菌的基因組DNA，操作方法按說明書進(jìn)行。以提取的布魯菌基因組DNA為模板，應(yīng)用合成的引物，PCR擴(kuò)增Omp16基因。反應(yīng)條件如下：95℃10min，80℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃ 延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用10 g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物用小量膠回收試劑盒回收純化。

1.2.3 基因的克隆與序列測定 將PCR回收產(chǎn)物和pET－32a載體用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切處理，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，并按照試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。將回收得到的目的基因和載體于16℃連接3h。10μL的連接體系如下：10×T4Ligase buffer 1μL，Omp16回收片段0.5μL ，pET－32a載體1μL ，T4DNA ligase 0.5 μL，ddH2O至10μL。常規(guī)方法轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)BL21中，涂布于含Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌6h，按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，鑒定正確的，送南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對。

1.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET－32a－Omp16轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21后，挑取陽性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床37℃、200r／min振搖培養(yǎng)過夜。取菌液按1∶100的比例接種至5 mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8時，加入終濃度1mmol／L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。取培養(yǎng)后的菌液2mL以12 000r／min離心2min，棄上清，沉淀加100μL PBS和25μL Loading buffer，振蕩混勻后煮沸10min，取20μL進(jìn)行120g／L SDS－PAGE電泳。

1.2.5 蛋白純化 500mL的培養(yǎng)液離心后在30 mL的細(xì)胞裂解液中裂解（100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，pH 7.4；并加入1mmol／L PMSF抑制蛋白質(zhì)降解）。冰浴30min后，對懸浮液進(jìn)行40W振幅和8s脈沖條件下超聲處理10 min。上述處理樣品在4℃、10 000r／min離心30 min。裂解液中的一小部分和離心后的沉淀物保存，用于SDS－PAGE分析，然后按照His Trap HP說明書中的步驟純化目的蛋白。純化過程中所用漂洗液成分 （100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，10mmol／L imidazole，pH7.4），洗脫液成分（100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，250 mmol／L imidazole，pH7.4），操作步驟按照 His Trap HP說明書進(jìn)行。

1.2.6 使 用 Triton X－100 和 β－巰 基 乙 醇 純 化Omp16蛋白 為了提高純化技術(shù)和獲得較高產(chǎn)量的純化蛋白，改變裂解緩沖液成分（200mmol／L urea，100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，20 mmol／Lβ－mercaptoethanol，10mL／L Triton X－100，10mmol／L imidazole，pH 8.0），并在此條件下使用洗滌緩沖液［8］。500mL培養(yǎng)物經(jīng)離心后加入到30mL改良后的裂解緩沖液中，加入1mmol／L PMSF抑制蛋白質(zhì)的降解。懸浮液混合均勻后在40W振幅和8s脈沖條件下超聲處理10min，室溫條件下孵育1h，10 000r／min離心30min，然后按照HisTrap HP說明書中的步驟純化目的蛋白。漂洗 液 成 分 （200mmol／L urea，100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，10mmol／L imidazole，pH 6.3），洗脫液成分（200mmol／L urea，100 mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，250 mmol／L imidazole，pH4.5）。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g／L的瓊脂糖凝膠電泳，在約500bp處出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與預(yù)期得到的目的基因大小相符（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增的Omp16基因Fig.1 PCR amplification results of Omp16gene

2.2 目的基因原核表達(dá)構(gòu)建

將pET32a重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳圖上分別出現(xiàn)507bp的DNA條帶和5 900bp的pET－32a載體條帶（圖2）。挑取陽性克隆送公司測序后表明，克隆的Omp16基因與GenBank上發(fā)表的布魯菌Omp16基因序列的同源性為99%。表明目的基因表達(dá)載體已正確構(gòu)建。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白各取20μL進(jìn)行120 mL／L的 SDS－PAGE 電泳，結(jié)果顯示，得到了與Omp16分子質(zhì)量相符的蛋白條帶（圖3）。

圖2 pET32a－Omp16重組質(zhì)粒EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET32a－Omp16with EcoRⅠand SalⅠdigestion

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)的Omp16重組蛋白Fig.3 The induced expression of Omp16recombinant protein

2.4 重組蛋白的純化

原條件下，菌體超聲裂解，細(xì)胞裂解液中重組蛋白的可溶部分非常少，大部分蛋白以包涵體的形式存在，而且純化出來的蛋白也混有一定的雜蛋白。改良條件下，菌體經(jīng)超聲裂解，細(xì)胞裂解液中重組蛋白的可溶部分比較多，但是大部分蛋白仍以包涵體的形式存在，但是純化出來的蛋白條帶單一，表明蛋白純度比較高，如圖所示（圖4和圖5）。

圖4 改良條件下Omp16重組蛋白的純化Fig.4 The purification of Omp16recombinant proteins under improved conditions

3 討 論

臨床上，對于人和動物布魯菌病的檢測主要是通過血清學(xué)診斷的方法。而以脂多糖（LPS）作為檢測的抗原通常會得到假陽性結(jié)果，近些年的研究表明，在布魯菌所有的抗原中，布魯菌外膜蛋白相比細(xì)菌裂解物、LPS有著更好的特異性和反應(yīng)靈敏度［9］。因而在大腸埃希菌里，通過基因工程的方法，依靠重組蛋白技術(shù)建立起來的直接或者間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)是診斷布魯菌病的常用方法之一 。由此看來，高效率高純度的蛋白重組表達(dá)技術(shù)對于未來布魯菌的防控就顯得尤為重要。

重組蛋白的表達(dá)技術(shù)通常使用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白通常適應(yīng)的標(biāo)簽有6×His，SUMO，MBP［10］。標(biāo)簽蛋白一般主要有兩種作用：一方面有助于重組蛋白的可溶性表達(dá)，另一方面標(biāo)簽蛋白為后來重組蛋白的純化提供了便利條件。在重組蛋白的誘導(dǎo)和純化過程中，大多數(shù)的蛋白經(jīng)常會以包涵體的形式存在，包涵體通常通過尿素處理，顯著的增加了重組蛋白的可溶性，然后通過親和層析的方法使得目的蛋白得以純化。然而即使是這樣有的蛋白即使是這樣也無法純化到，而且費事費力。因此，在本研究中，我們通過改進(jìn)改進(jìn)蛋白純化方法，添加Triton X－100和β－巰基乙醇，通過改進(jìn)菌體裂解液，漂洗液，洗脫液增加了可溶性蛋白的含量，同時提高了蛋白的純度，這為以后臨床上對于人和動物布魯菌病的檢測提供了便利，為以后實驗研究提供了必要的物質(zhì)材料。

一般動物在感染布魯菌1周之后機(jī)體內(nèi)會有抗體出現(xiàn)，檢測血清中的抗體是布魯菌診斷和檢疫的主要手段［11］。血清學(xué)診斷包括試管凝集試驗（SAT）、虎紅平板凝集試驗（RBPT）、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（CFr）、全乳環(huán)狀試驗（CYT）等［12］。血清學(xué)檢測方法較多，且各有特色，但目前還沒有一種完美的方法［13］。因此，在實際工作中，最好用一種以上的方法相互配合。國內(nèi)常用RBPT和CYT進(jìn)行現(xiàn)場或牧區(qū)的大規(guī)模檢疫，以SAT和CFr進(jìn)行實驗室最后確診［14］。對于疑難的病例，還可選用抗球蛋白試驗、巰基乙醇凝集試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗或酶聯(lián)免疫吸時試驗。本研究中，通過改進(jìn)改進(jìn)蛋白純化方法，有效的提高了重組蛋白的可溶性和純度，為臨床上通過血清學(xué)診斷的方法并結(jié)合其他方法對布魯菌病監(jiān)測提供了便利。

克隆了布魯菌Omp16基因，其蛋白在大腸埃希菌BL21成功進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，在原純化條件下，目的蛋白主要存在于包涵體內(nèi)，可溶性部分比較少，在改進(jìn)條件下目的蛋白的可溶性部分顯著增加，此外，在原來條件下目的蛋白純化量比較少，有雜蛋白污染，在改進(jìn)條件下蛋白純化量有了比較顯著的提高，沒有雜蛋白污染。本研究中形成的純化程序可能對其他在大腸埃希菌中作為包涵體表達(dá)的重組蛋白的高效純化有所幫助。

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