羅思思，謝芝勛＊，劉加波，陳敏玫，楊進(jìn)業(yè)，

鄧顯文1，謝志勤1，龐耀珊1，謝麗基1，范 晴1

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心，廣西南寧530028）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差異，AIV可進(jìn)一步分為不同的亞型，目前已鑒別出16種HA（H1～H16）和9種NA（N1～N9）［1］。AIV 是一種有囊膜、單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，基因組分為8個(gè)節(jié)段，分別編碼 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白［2］。

由于禽流感病毒基因組分節(jié)段的特征，AIV較易發(fā)生變異，主要有抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換兩種方式。前者由于聚合酶保真性較低，在病毒復(fù)制過程中，HA和NA基因有可能逐步發(fā)生核苷酸點(diǎn)突變，不斷積累可使表面抗原發(fā)生顯著的變化，產(chǎn)生新的變異株；抗原轉(zhuǎn)換是當(dāng)兩種以上不同亞型的AIV共同感染同一細(xì)胞時(shí)，不同毒株的8個(gè)基因片段通過基因重排，產(chǎn)生新的毒株。變異后的毒株致病性是未知的，有可能突破種間屏障，直接傳染給人類，造成的后果無法估量。2009年，甲型H1N1流感的暴發(fā)，該H1N1毒株的基因組就是由豬源、人源和禽源等不同來源的片段構(gòu)成［3］。

自2013年2月以來，上海市、安徽省、江蘇省和浙江省等地先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例。國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)3月31日通報(bào)，上海、安徽發(fā)生3人感染H7N9禽流感確診病例，2例上?；颊咭阉劳?。自2002年以來，全球報(bào)道的人感染H7亞型AIV病例超過100人，臨床表現(xiàn)由結(jié)膜炎至輕微的上呼吸道疾病甚至是肺炎［4］。H7N9亞型AIV以往僅在禽間發(fā)現(xiàn)，在荷蘭、日本及美國(guó)等地曾暴發(fā)過禽間疫情，但從未發(fā)現(xiàn)過人的感染情況。此次人感染H7N9亞型AIV，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒。截至2013年5月29日，全國(guó)已確診H7N9亞型AIV感染131人，其中37人死亡，76人痊愈。

針對(duì)以上現(xiàn)狀和目前的情勢(shì)，急需建立H7N9亞型AIV的快速檢測(cè)方法，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR已用于多種病原體的鑒別檢測(cè)［5－6］。本研究設(shè)計(jì)了專門針對(duì)H7N9亞型AIV的引物和探針，建立雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR（Real－time RT－PCR）進(jìn)行檢測(cè)，既可確定H7N9亞型AIV感染，也可同時(shí)確定是否為單個(gè)H7、N9亞型AIV感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光PCR Premix ExTaq酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；pGEM－T Easy載體為Promaga公司產(chǎn)品。

1.1.2 毒株 AIV（H2N3、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4和 H10N3）［6］RNA 由香港大學(xué)惠贈(zèng)；AIV（H1N7和H11N9）由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；H7N9亞型AIV的陽性RNA由廣西壯族自治區(qū)疫病控制中心惠贈(zèng)；AIV（H3N2、H6N6、H9N2）［7－9］、新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）和傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所分離保存。

1.2 方法

1.2.1 引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)Gen－Bank中H7N9亞型AIV HA基因和NA基因的保守序列，參考2013年3月分離的H7N9亞型AIV杭州株A／Hangzhou／1／2013（H7N9）的 HA和 NA序列，分別設(shè)計(jì)了能檢測(cè)H7亞型、N9亞型AIV的2對(duì)特異性引物和2條TaqMan探針，通過NCBI BLAST驗(yàn)證，保證引物擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的靶基因，不與其他亞型AIV發(fā)生交叉。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄 按照 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction試劑盒說明書，抽提病毒的RNA，以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：5×reverse transcriptase buffer 10μL，50pmol random primer（9mer）1μL，10mmol／L dNTP mixture 2μL，40Uribonuclease inhibitor 0.6μL，5 U／μL AMV reverse transcriptase 1μL，模板 RNA 1pg～1μg，DEPC水補(bǔ)足至50μL，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化20μL PCR反應(yīng)體系：2×premixExTaq酶10μL，正、反引物和探針終濃度在 0.1μmol／L～0.8 μmol／L之間調(diào)整，cDNA 2μL，以無RNA酶的超純水補(bǔ)足20μL。雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR各循環(huán)參數(shù)和引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR模式。

1.2.4 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 將AIV （H7N2、H11N9、H7N9、H1N7、H2N3、H3N2、H4N5、H5N3、H6N6、H8N4、H9N2和 H10N3）、NDV、IBV和ILTV的cDNA／DNA分別加入到雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)其特異性。

1.2.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以H7N9亞型AIV HA基因和NA基因全長(zhǎng)引物分別與對(duì)應(yīng)的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接到pGEM－T Easy載體，提取陽性克隆質(zhì)粒AIVH7和AIV－N9，送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)分子質(zhì)量及濃度計(jì)算各質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

1.2.6 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn) 把AIV－H7和AIV－N9的質(zhì)粒，10倍為梯度倍比稀釋，同時(shí)加入到最佳的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其敏感性。

1.2.7 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，模板是H7N9亞型AIV的cDNA陽性樣品。分為3個(gè)標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)。通過計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)來驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量PCR的批內(nèi)重復(fù)性。在第4天、第7天后重復(fù)檢測(cè)保存于－20℃的模板，來驗(yàn)證模板的穩(wěn)定性及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的批間重復(fù)性。

1.2.8 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR干擾性試驗(yàn) 將AIV H7和AIV N9質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按不同的拷貝數(shù)進(jìn)行組合，分別用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR和單項(xiàng)熒光PCR檢測(cè)，確定模板濃度相差較大時(shí)二者的檢測(cè)是否存在干擾。

2 結(jié)果

2.1 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件的優(yōu)化

對(duì)PCR引物濃度、反應(yīng)溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR中 H7－1、H7－2、N9－1和 N9－2引物對(duì)的最佳工作終濃度為0.2μmol／L，H7－3和 N9－3探針最佳工作終濃度分別為0.4μmol／L和0.2μmol／L，PCR的最佳反應(yīng)模式為，94℃30s，94℃5s，60℃20s，40個(gè)循環(huán)；最后于40℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用最佳反應(yīng)條件，對(duì)AIV、NDV、IBV和ILTV核酸進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖1），H7N2AIV在FAM熒光通道（530nm激發(fā)光下）出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，在ROX熒光通道（610 nm激發(fā)光下）為直線，H11N9AIV在FAM熒光通道為直線，而在ROX熒光通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，H7N9亞型AIV在FAM和ROX熒光通道均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，而其他亞型AIV和其他常見呼吸道禽病的病毒在FAM和ROX熒光通道檢測(cè)均為直線，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。

圖1 Real－time RT－PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The specificity assay of Real－time RT－PCR

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用所建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)AIV H7HA質(zhì)粒和N9NA質(zhì)粒，結(jié)果顯示（圖2和圖3），H7亞型AIV的檢測(cè)下限為1×101copies／μL，N9亞型AIV的檢測(cè)下限為1×102copies／μL，因此，H7N9亞型AIV的檢測(cè)限為1×102copies／μL。

圖2 Real－time RT－PCR敏感性試驗(yàn)（FAM 通道）Fig.2 The sensitivity assay of Real－time RT－PCR（FAM channel）

圖3 Real－time RT－PCR敏感性試驗(yàn)（ROX通道）Fig.3 The sensitivity assay of Real－time RT－PCR（ROX channel）

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

在批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，對(duì)H7N9亞型AIV cDNA模板進(jìn)行3次平行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，3個(gè)平行反應(yīng)在相應(yīng)的熒光通道下均獲得擴(kuò)增曲線，H7亞型AIV通道Ct值變異系數(shù)為0.8%，N9亞型AIV通道Ct值變異系數(shù)為1.0%，對(duì)上述模板，以相同反應(yīng)條件3d和7d后進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，Ct值變異系數(shù)均小于3%。結(jié)果表明，本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性良好，可以滿足臨床檢測(cè)的要求（圖4）。

2.5 干擾性試驗(yàn)結(jié)果

將AIV H7和AIV N9質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板按不同濃度進(jìn)行組合時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)模板濃度高而另一個(gè)模板濃度低時(shí)，仍可在不同的熒光通道下分別檢測(cè)到2個(gè)模板，并與單重?zé)晒釶CR檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。

圖4 Real－time RT－PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The repeatability assay of Real－time RT－PCR

3 討論

H7N9亞型禽流感是一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)，接著陸續(xù)在浙江、江蘇、河南、北京、臺(tái)灣、山東、福建等地發(fā)現(xiàn)該病毒引起的病例，引起世界的廣泛關(guān)注。H7N9亞型AIV的發(fā)病特征為典型的病毒性肺炎，發(fā)病急，病程早期均有高熱（38℃以上）、咳嗽等呼吸道感染癥狀。發(fā)病5d～7d出現(xiàn)呼吸困難，重癥肺炎并進(jìn)行性加重，部分病例可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征并死亡，至今沒有證據(jù)確認(rèn)新型H7N9禽流感病毒能在人與人之間傳播［10］。

此次發(fā)現(xiàn)的新型H7N9禽流感病毒是由不同亞型AIV通過抗原轉(zhuǎn)換的方式發(fā)生基因重排產(chǎn)生的，在8個(gè)基因片段中，H7片段來源于浙江鴨群中分離的AIV，并可追溯至東亞地區(qū)野鳥中分離的相似病毒；N9片段與東亞地區(qū)野鳥中分離的AIV同源；其余6個(gè)基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）來源于H9N2AIV，病毒基因組比對(duì)和親緣性分析顯示H9N2AIV來源于中國(guó)上海、浙江、江蘇等地的雞群［11－12］。

本研究針對(duì)H7N9亞型AIV的HA基因和NA基因保守序列，通過Primer Express 3.0軟件，設(shè)計(jì)了多套探針和引物，通過分析其特異性和引物之間的二聚體，篩選出了2套熒光TaqMan探針和引物，構(gòu)成專門針對(duì)H7N9亞型AIV的引物組和探針組。在常規(guī)PCR引物的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記2個(gè)熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，在雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的退火過程中，探針被水解，報(bào)告熒光信號(hào)得以釋放出來而被儀器檢測(cè)到，從而達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的。通過優(yōu)化引物和探針的濃度，得到最佳的反應(yīng)條件，建立了H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)方法，一管檢測(cè)既可確定H7N9亞型AIV感染，也可鑒別單個(gè)H7亞型或N9亞型AIV感染，且相互間沒有干擾，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。

本研究建立的H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高（是常規(guī)PCR的100倍以上）、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單和污染環(huán)境的機(jī)會(huì)少（不需要EB染色）等優(yōu)點(diǎn)，而且整個(gè)反應(yīng)可在30min左右完成，在同一反應(yīng)體系中，加入2對(duì)引物和2條探針，同時(shí)檢測(cè)2個(gè)目的基因，一管多檢，省時(shí)省力。此外，擴(kuò)增過程可以直接通過電腦實(shí)時(shí)觀察，反應(yīng)結(jié)束便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果，結(jié)果判定更簡(jiǎn)便、直觀和實(shí)用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H7N9亞型AIV的快速檢測(cè)，同時(shí)還可確定H7亞型AIV、N9亞型 AIV感染，應(yīng)用前景廣闊，對(duì)H7N9禽流感的早期診斷和有效防控具有重要意義。

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