孫 潔，盧體康，曾少靈，楊俊興，詹愛軍，林慶燕，曹琛福，陳 兵，

廖立珊1，阮周曦1，陶 虹1，張彩虹1，劉建利1，花群義1，3，呂建強(qiáng)1，3，秦智鋒1、2，3＊

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳市518001；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳市518001；3.深圳市外來有害生物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518045）

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一種家禽急性、接觸傳染性的烈性傳染病。目前本病是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一，呈世界性分布，以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征，從而引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)和對(duì)外貿(mào)易的不斷發(fā)展，我國(guó)近年來頻繁引進(jìn)種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品，對(duì)引進(jìn)的種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品的檢疫已成為動(dòng)物檢疫的一個(gè)重要工作。在對(duì)引進(jìn)的種雞和種蛋的進(jìn)出境檢疫過程中，鑒于雞傳染性法氏囊病傳染方式廣泛，可隨蛋進(jìn)行垂直傳播的特性，因此，世界各國(guó)均對(duì)此病進(jìn)行重點(diǎn)防控，是各國(guó)進(jìn)出口種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品必定檢疫的項(xiàng)目之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）也將此病進(jìn)行收錄，認(rèn)為其是影響國(guó)際動(dòng)物及其產(chǎn)品貿(mào)易的重大動(dòng)物疫?。?－5］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2009年公布的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中，把本病列為二類動(dòng)物傳染病進(jìn)行重點(diǎn)防控。到目前為止，我國(guó)有關(guān)雞傳染性法氏囊病的標(biāo)準(zhǔn)有2個(gè)，但缺少必要的快速分子生物學(xué)診斷方法［6－8］。近10年來，RT－PCR 和實(shí)時(shí)熒光定 量 RT－PCR 技 術(shù) （Real－time RT－PCR，rRTPCR）在3h～4h內(nèi)快速診斷田間樣品方面取得了快速發(fā)展［9］。本研究借助普遍使用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，建立了特異性快速檢測(cè)IBDV的RT－PCR和rRT－PCR方法，并對(duì)田間樣品進(jìn)行了大量普查監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 傳染性法氏囊病疫苗－法倍靈（IBDVBLEN），購(gòu)自美國(guó)梅里亞公司；傳染性法氏囊標(biāo)準(zhǔn)毒株（CJ801－BKF）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)；傳染性法氏囊病湖北分離株（IBDV－HB）、傳染性法氏囊病武漢分離株（IBDV－WH）、傳染性法氏囊病強(qiáng)毒廣東分離株（IBDV －GDW）和廣西分離株（IBDV－GX），新城疫病毒、馬立克病病毒、傳染性支氣管炎病毒均為本室分離鑒定保存；禽流感病毒H5亞型抗原、禽流感病毒H7亞型抗原和禽流感病毒H9亞型抗原，購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試劑 一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR試劑盒：AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit，ABI公司產(chǎn)品；一步法RT－PCR試劑盒：QIAGEN OneStep RT－PCR Kit，Qiagen公司產(chǎn)品；一步法 RT－PCR試劑盒：TaKaRa OneStep RT－PCR Kit，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒核酸抽提試劑盒：Qiagen Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品。

1.1.3 設(shè)備 ABI 7500HT熒光定量PCR儀，Qiagen EZ1advanced全自動(dòng)核酸抽提工作站，核酸蛋白分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì) 采用OIE推薦的IBDV的引物，具體如下：

針對(duì)A片段VP2基因的引物：

引物由3段序列組成：由5′端到3′端依次為通用引物M13或R13（黑體部分）序列，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（下劃線部分），IBDV特異性序列（斜體部分）。M13或R13序列為多數(shù)測(cè)序反應(yīng)中的測(cè)序引物，便于對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引入，使得IBDV經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物可用限制性內(nèi)切酶SphⅠ（引物U3）、EcoRⅠ（引物L(fēng)3和＋290）、PstⅠ（引物－861）進(jìn)行酶切后連入載體中。引物U3和L3分別對(duì)應(yīng)Acc No X84034毒株序列片段A的657～676和1193～1212位置，引物＋226和－861分別對(duì)應(yīng)Acc No AF240687毒株序列片段B中的290～311和861～883位置。A片段擴(kuò)增產(chǎn)物為604bp，B片段擴(kuò)增產(chǎn)物為642bp，引物擴(kuò)增片段適合進(jìn)行IBDV分子進(jìn)化分析和流行病學(xué)研究。

將各個(gè)年代、各個(gè)毒力、各個(gè)地區(qū)的主要代表毒株的A片段VP2全基因序列下載，用bioEdit（7.0.9.0）軟件，以Clusal W方式進(jìn)行排列，找出IBDV最保守的21個(gè)寡核苷酸來設(shè)計(jì)探針，再在探針兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的上、下游引物。引物和探針采用Primer Express 2.0軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)［4］。設(shè)計(jì)的引物與探針序列見表1，探針的5′端用FAM標(biāo)記，探針的3′端用BHQ基團(tuán)淬滅，引物和探針均由上海基康生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100μmol／L儲(chǔ)存液，置－20℃或更低溫度凍存。使用時(shí)引物配制成10μmol／L工作液，探針配制成5μmol／L工作液，避免多次凍融。

表1 雞傳染性法氏囊病病毒引物與探針Table 1 Primers and probes for IBDV

1.2.2 兩種RT－PCR檢測(cè)方法的復(fù)核與優(yōu)化 參照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明書，于全自動(dòng)核酸抽提工作站中抽提IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDVGX、新城疫病毒、馬立克病病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)HI檢測(cè)抗原等11株病毒的核酸和陰性對(duì)照尿囊液中的病毒核酸。

按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)方法的步驟和程序，采用TaKaRa公司一步法RT－PCR檢測(cè)試劑盒和Qiagen公司一步法RT－PCR檢測(cè)試劑盒，對(duì)IBDVBLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW、IBDV－GX和對(duì)照病毒進(jìn)行檢測(cè)。

在此基礎(chǔ)上，以TaKaRa公司一步法RT－PCR檢測(cè)試劑盒，對(duì)兩種RT－PCR檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，以建立適合我 國(guó) 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)方法。

1.2.3 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立 選取1.2.2抽提好的核酸，參照ABI公司AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit操作說明書配制熒光定量RTPCR反應(yīng)液：每個(gè)25μL的反應(yīng)體系中包含2×RT－PCR母液12.5μL，酶混合物1μL，10μmol／L IBDV－FP 1 μL，10 μmol／L IBDV－RP 1 μL，5μmol／L IBDV－Pb 1μL，無核酸酶的水3.5μL，RNA模板5μL。

于ABI 7500熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：50℃45min；95℃10min；95℃10 s，60℃30s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置60℃ 時(shí)收集FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。

1.2.4 OIE推薦的兩種RT－PCR檢測(cè)方法與IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法靈敏度比對(duì) 選取IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用無核酸酶的水10倍系列稀釋成1×10－1～10－10等10個(gè)稀釋度，重新抽提核酸。按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR 兩 種 RT－PCR 檢 測(cè) 方法，與所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR 方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)比對(duì)，確定所建立方法的靈敏度。

1.2.5 IBDV－VP2－rRT－PCR特異性試驗(yàn) 用建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法，對(duì)6株IBDV毒株進(jìn)行檢測(cè)，確定所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法特異性。利用本研究所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的雞肉正常組織、雞血清樣品、火雞肌肉組織、鴿組織、正常雞胚尿囊液、其他家禽病毒和細(xì)菌共12份非IBDV病毒樣品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定所建立方法的特異性。

1.2.6 田間試驗(yàn) 自2007年以來，采用所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法，對(duì)注冊(cè)禽場(chǎng)采集18批221份樣品進(jìn)行雞傳染性法氏囊病毒監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)陽性則用雞胚進(jìn)行病毒分離鑒定和用IBDVVP2（604）－RT－PCR 和 IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)確證。

2 結(jié)果

2.1 兩種RT－PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化結(jié)果

按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)方法的步驟和程序，采用Qiagen公司的一步法RT－PCR檢測(cè)試劑盒，IBDV－VP2（604）－RT－PCR 可以檢測(cè)出604bp條帶，IBDV－VP1（642）－RT－PCR 可以檢測(cè)出642bp條帶，但條帶微弱。采用TaKaRa公司一步法RTPCR檢測(cè)試劑盒，則兩種RT－PCR結(jié)果均為陰性。

以Qiagen公司一步法RT－PCR檢測(cè)試劑盒，對(duì)兩種RT－PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)條件反復(fù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件為：第一步：反轉(zhuǎn)錄50℃45min；第二步：94℃5min（如果為熱啟動(dòng)一步法RT－PCR試劑盒，則需要95℃15min）；第三步：94℃30s，54℃45s，72℃1min 30s，5個(gè)循環(huán)；第四步：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，30個(gè)循環(huán)；第五步：72℃延伸10min。對(duì)6株IBDV毒株用優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

2.2 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立

在25μL反應(yīng)體系中，在設(shè)定的反應(yīng)條件下于ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)。在陰性對(duì)照成立的情況下，6株IBDV毒株出現(xiàn)特異性的實(shí)時(shí)擴(kuò)增，其他禽病病毒和陰性組織樣品均沒出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，相互之間無交叉反應(yīng)。6株IBDV 毒株IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV －GDW 和 IBDV－GX 的 Ct 值 分 別 為 23.93、23.55、16.46、14.28、19.53、14.37；陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)（圖2）。

2.3 三種分子生物學(xué)檢測(cè)方法靈敏度比較結(jié)果

將10倍系列稀釋的IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用 OIE 推 薦 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR、IBDVVP1（642）－RT－PCR 檢測(cè)方法和IBDV－VP2－rRTPCR檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法的靈敏度為 10－4（圖3），IBDV－VP2（604）－RT－PCR 檢測(cè)方法和IBDVVP1（642）－RT－PCR 檢測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)，均為10－3（圖4），比所建立的rRT－PCR檢測(cè)方法的靈敏度低10倍。所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法 檢 測(cè) IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDV－GX 等6株IBDV毒株的檢出率為100%（6／6），無漏檢現(xiàn)象發(fā)生。

圖1 6株IBDV毒株用優(yōu)化的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for 6IBDV strains

2.4 IBDV－VP2－rRT－PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)6株IBDV毒株用建立的IBDV－VP2－rRTPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，均能特異性地檢測(cè)出6株IBDV毒株，其他家禽病毒均沒有擴(kuò)增結(jié)果。表明所建立的方法特異性強(qiáng)，相互之間無交叉反應(yīng)（圖2）。通過對(duì)12份非IBDV樣品的檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性，表明所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)方法的特異性為100%（18／18）。說明該方法特異性強(qiáng)，與其他檢測(cè)對(duì)象無交叉反應(yīng)。

圖2 6株IBDV毒株IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The results of IBDV－VP2－rRT－PCR for 6IBDV strains

圖3 IBDV－VP2－rRT－PCR檢測(cè)IBDV－BLEN弱毒疫苗株的靈敏度測(cè)定結(jié)果Fig.3 Sensitivity of the IBDV－VP2－rRT－PC for IBDV－BLEN vaccine

2.5 田間試驗(yàn)結(jié)果

2007年－2011年采集注冊(cè)禽場(chǎng)血液和組織樣品18批221份田間樣品進(jìn)行普查監(jiān)測(cè)，雞傳染性法氏囊病普查監(jiān)測(cè)表明，IBDV－VP2－rRT－PCR篩選檢測(cè)陽性共8份，陽性率為3.62%。樣品經(jīng)雞胚尿囊膜接種后，再采用IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR方法檢測(cè)，結(jié)果完全相符。

3 討論

3.1 建立傳染性法氏囊病病毒分子生物學(xué)檢測(cè)的意義和必要性

近年來，傳染性法氏囊病的流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，其臨床癥狀呈不典型性，免疫失敗現(xiàn)象亦非常嚴(yán)重，因此對(duì)本病的早期診斷就顯得尤為重要。IBD的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法有瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、病毒中和試驗(yàn)（VN）等。這些方法在特異性、敏感性和時(shí)效性等方面存在著一定的不足，不利于疫情的早期發(fā)現(xiàn)［10－14］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對(duì)IBDV的深入研究，新的診斷方法不斷涌現(xiàn)，尤其是分子生物學(xué)診斷技術(shù)以其靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在IBD的早期診斷中得到了廣泛的應(yīng)用［15－16］。本研究建立的IBDV普通 RT－PCR方法和熒光定量RT－PCR方法將為今后IBD的快速診斷、病原學(xué)研究提供了有力的工具。

圖4 IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測(cè)IBDV－BLEN弱毒疫苗株的靈敏度測(cè)定結(jié)果Fig.4 Sensitivity of the IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for IBDV－BLEN vaccine

3.2 IBDV－VP2－rRT－PCR與普通RT－PCR檢測(cè)靈敏度和特異性比較

本研究建立的普通RT－PCR方法分別針對(duì)了IBDV的VP1和VP2基因片段中的保守序列，引物擴(kuò)增片段適合進(jìn)行IBDV分子進(jìn)化分析和流行病學(xué)研究；IBDV－VP2－rRT－PCR方法針對(duì) VP2基因，兩種方法均可以特異性地檢測(cè)IBDV，與其他病毒之間不存在交叉性。

OIE推薦的四步反應(yīng)條件中PCR的擴(kuò)增步驟為：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。這個(gè)反應(yīng)條件采用進(jìn)口的Qiagen公司的一步法RT－PCR檢測(cè)試劑可以擴(kuò)增出2個(gè)目的片段，但擴(kuò)增效率不高，有時(shí)條帶比較微弱。鑒于PCR引物人工加尾太長(zhǎng)，如果采用太高的退火溫度可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增之初不能使引物與模板有效結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不高或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。為了提高特異生，所以在PCR擴(kuò)增之前增加了一個(gè)低的退火溫度54℃，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增。等擴(kuò)增出帶有引物的片段后，再在高的退火溫度64℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果無論是采用國(guó)產(chǎn)的還是進(jìn)口的一步法RTPCR檢測(cè)試劑盒，均可有效地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于人醫(yī)的臨床檢測(cè)和獸醫(yī)的臨床診斷。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法已在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)、檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)廣泛使用。RT－PCR檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)方法雖然都可以對(duì)IBD進(jìn)行確診，相對(duì)于普通RT－PCR方法，本研究建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法的檢測(cè)靈敏度比普通RT－PCR方法高10倍，同時(shí)摒棄了傳統(tǒng)電泳方法，時(shí)效性更佳，實(shí)現(xiàn)了對(duì)IBDV的實(shí)時(shí)檢測(cè)監(jiān)控，為IBD的防控奠定了基礎(chǔ)。

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