鄧顯文，謝芝勛，劉加波，謝志勤，龐耀珊，謝麗基，范 晴，羅思思

（廣西獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

腸炎沙門菌是目前引起人類食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis）污染的動(dòng)物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年來(lái)，腸炎沙門菌食物中毒和動(dòng)物感染腸炎沙門菌十分嚴(yán)重，已引起畜禽防疫和公共衛(wèi)生界的高度重視［1－4］。目前應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)SE的檢測(cè)已有報(bào)道［5－7］，PCR檢測(cè)方法雖然快速、敏感性較高，但只是對(duì)病原DNA檢測(cè)。ELISA是當(dāng)前生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)檢測(cè)方法，具有特異、快速、簡(jiǎn)便、敏感性高等特點(diǎn)［8－10］。本研究利用PCR方法擴(kuò)增SE的fliC基因主要抗原區(qū)，連接于表達(dá)載體pGEX－4T－1中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX－fliC，融合表達(dá)了重組鞭毛蛋白，初步建立了flic－ELISA檢測(cè)腸炎沙門菌抗體的方法，為給臨床檢測(cè)腸炎沙門菌提供一種敏感度高、特異性強(qiáng)的血清學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 腸炎沙門菌（SE28、SE29、SE30、SE75、SE90、SE221、SE635）、傷 寒 沙 門 菌（S.typhi）、副傷寒沙門菌（S.parutyphi）、雞沙門菌（S.pullerium）由美國(guó)康州大學(xué)Khan教授惠贈(zèng)，馬流產(chǎn)沙門菌（CVCC514）、腸炎沙門菌（CVCC2182、CVCC2184）、豬霍亂沙門菌（CVCC2179）、傷寒沙門菌（CVCC2213）、雷丁沙門菌（CVCC2210）、甲型副傷寒沙門菌（CVCC2189）、鼠傷寒沙門菌（CVCC2233）、腸 炎 沙 門 菌 亞 種 （CVCC3374、CVCC3375、CVCC3377、CVCC3378）由中國(guó)國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買；雞毒支原體（IC）、傳染性鼻炎（IC）、禽流感病毒（AIV）、雞新城疫病毒（NDV）陽(yáng)性血清，載體pMD18－T，受體菌DH5α，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 96孔酶標(biāo)板，羊抗雞IgGHRP，BSA及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 腸炎沙門菌鞭毛蛋白的克隆及鑒定 根據(jù)腸炎沙門菌fliC基因設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，引物的5′端分別含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)為285bp。fliC1：5′－CCAGGAATTCACTAAATCTACTGCTGGTACCGC－3′；fliC2：5′－CCGCTCGAGTTATCATCAAAAGTAAACTGACCGT－3′。將純化后的SE28－filC基因酶切產(chǎn)物克隆到pGEX－4T－1，轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序分析獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEX－filC。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)純化及 Western blot分析蛋白活性 用IPTG誘導(dǎo)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX－fliC培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白，用SDS－PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。利用谷胱甘肽親和的方法，純化重組蛋白，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)重組蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性。

1.2.3 重組蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 血清的制備 分別用純化的pGEX－fliC重組蛋白（最終含量為1mg／只）、甲醛滅活的腸炎沙門菌的13株和其他血清型沙門菌10株（菌含量4×106／mL）與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合，分別免疫14日齡SPF雞，0.4mL／只，每個(gè)血清型免疫3只，共計(jì)SPF雞72只，2周后將弗氏完全佐劑改為弗氏不完全佐劑進(jìn)行第2次免疫，免疫后2周采血，分離血清即為免疫血清。

1.2.3.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的選擇 采用雙方陣試驗(yàn)：用0.05mol／L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）把純化的重組蛋白（濃度為30mg／mL）作稀釋后分別為0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001、0.000 5、0.000 2、0.0mg／mL，包被反應(yīng)板100μL／孔，37℃孵育0.5h后4℃過(guò)夜。將包被好的酶標(biāo)板倒去孔內(nèi)液體，PBS－T洗滌3次后，用50g／L的脫脂奶封閉液37℃封閉0.5h，陽(yáng)性血清及SPF雞陰性血清分別用10g／L的BSA稀釋50、100、200、400倍，與重組蛋白不同稀釋度組成方陣，100μL／孔。37℃孵育1h，PBS－T洗滌3次后加入稀釋好的酶標(biāo)抗體HRP－羊抗雞IgG（3 000倍稀釋）100μL／孔，37℃孵育1h，洗滌后加入新鮮配制的顯色液100μL／孔，顯色10min，加50μL終止液。在酶標(biāo)儀上讀出OD450nm數(shù)值，比較陰、陽(yáng)性血清的OD值，以陽(yáng)性O(shè)D450nm值接近1.0，陰、陽(yáng)血清光吸收值差最大的血清最高稀釋倍數(shù)為最適血清稀釋度，所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為抗原的最佳稀釋度。

1.2.3.3 重組抗原包被條件的確定 以最適抗原濃度包被酶標(biāo)板，100μL／孔，在37℃分別包被0.5、1.0、1.5、2.0h后4℃過(guò)夜；以50g／L脫脂奶封閉進(jìn)行ELISA，在酶標(biāo)儀上讀出OD450nm值，比較陰陽(yáng)性血清的OD450nm值，以P／N值最大的包被條件為最佳。

1.2.3.4 血清最適作用時(shí)間的選擇 以最適抗原濃度包被酶標(biāo)板，陽(yáng)性血清做1∶100稀釋，分別作用30、60、90、120min，每組各設(shè)3個(gè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，按間接ELISA程序進(jìn)行，選取陽(yáng)性O(shè)D450nm值在1.0附近，P／N比值最大的一組作為最適血清作用時(shí)間。

1.2.3.5 酶標(biāo)二抗最適作用時(shí)間的選擇 以最適抗原濃度包被酶標(biāo)板，陽(yáng)性血清做1∶100稀釋，作用60min，酶標(biāo)二抗1∶3 000稀釋后，分30、60、90、120min的時(shí)間試驗(yàn)組，每組各設(shè)3個(gè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。按間接ELISA程序進(jìn)行，選取陽(yáng)性O(shè)D450nm值在1.0附近，P／N比值最大的一組作為最佳的二抗作用時(shí)間。

1.2.3.6 確定底物顯色時(shí)間 用抗原包被好的反應(yīng)板，按照前面設(shè)定的ELISA程序依次包被、封閉、加入陰、陽(yáng)性血清，再和酶標(biāo)二抗反應(yīng)60min之后加底物顯色，在室溫條件下不同時(shí)間（5、8、10、15 min）內(nèi)測(cè)定它們的OD450nm值。選取P／N比值較大，陽(yáng)性O(shè)D450nm值在1.0附近，陰性O(shè)D450 nm值較小的一組作為最佳的底物顯色時(shí)間。

1.2.3.7 陰、陽(yáng)臨界值的確定 用建立的flic－ELISA方法，分別檢測(cè)SPF雞陰性血清50份，測(cè)定OD450nm值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算平均值（ˉX）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），按照公式：ˉX＋3SD 計(jì)算陽(yáng)性和陰性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3.8 特異性試驗(yàn) 用純化的重組蛋白包被抗原，分別選用與腸炎沙門菌的13株和其他血清型沙門菌10株及雞毒支原體（IC）、傳染性鼻炎（IC）、禽流感病毒（AIV）、雞新城疫病毒（NDV）陽(yáng)性血清反應(yīng)，按照ELISA程序檢測(cè)其特異性。

1.2.3.9 敏感性檢驗(yàn) 將SE陽(yáng)性血清分別做1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶640、1∶1 280倍稀釋，用建立的flic－ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.10 重復(fù)性檢驗(yàn)

1.2.3.1 0.1 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 在用同批次純化的重組蛋白作為抗原，加入隨機(jī)抽取的20份SE陽(yáng)性血清，用建立的flic－ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，隔天檢測(cè)1次，共檢3次，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其結(jié)果。

1.2.3.1 0.2 批間重復(fù)試驗(yàn) 在用3個(gè)不同批次純化的重組蛋白作為包被抗原，加入隨機(jī)抽取的20份SE陽(yáng)性血清，用建立的flic－ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 flic－ELISA 方法的應(yīng)用 用建立的flic－ELISA方法檢測(cè)90份廣西某雞場(chǎng)未接種過(guò)SE的血清樣品。

2 結(jié)果

2.1 腸炎沙門菌鞭毛蛋白的克隆及鑒定

本試驗(yàn)用腸炎沙門菌SE28經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的fliC基因片段在285bp左右，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切純化后克隆到PGEX－4T－1，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序分析獲得重組的表達(dá)質(zhì)粒pGEX－filC，與理論值相符（圖1）。

2.2 重組蛋白的表達(dá)純化及 Western blot分析蛋白活性

經(jīng)1.5mmol／L ITPG誘導(dǎo)后，重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，結(jié)果重組蛋白大小約為37ku，以水溶性形式表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果相符合（圖2）。采用谷胱甘肽親和回收純化后的filc重組蛋白經(jīng) Western blot檢測(cè)，目的條帶明顯、清晰，能與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性（圖3）。

圖1 PCR和酶切鑒定Fig.1 PCR and enzyme digestion identification

圖2 pGEX－fliC在大腸埃希菌中的表達(dá)Fig.2 pGEX－fliC expressed in E.coli

2.3 重組蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立

2.3.1 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 重組蛋白ELISA方陣試驗(yàn)結(jié)果（表1）可知當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.01 mg／mL時(shí)，其陽(yáng)性O(shè)D450nm值接近1.0且陰、陽(yáng)數(shù)值之比（P／N）比值最大為20.5，此時(shí)血清為100倍稀釋。因此可以確定重組蛋白ELISA抗原的最佳濃度為0.01mg／mL，血清的最適稀釋度為100倍。通過(guò)對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定抗原的包被條件為37℃作用0.5h后4℃過(guò)夜；封閉液為50 g／L脫脂奶，封閉時(shí)間為0.5h；血清最佳作用時(shí)間為1h，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度1∶3 000倍稀釋，作用時(shí)間為1h，底物作用時(shí)間為10min。

圖3 pGEX－fliC Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of pGEX－fliC

2.3.2 ELISA 程序確定 pGEX－fliC蛋白以最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，100μL／孔，37℃作用0.5h后4℃過(guò)夜，包被液甩干后，PBST洗滌3次，加50 g／L的脫脂奶200μL／孔，37℃封閉0.5h，PBST洗滌3次，各孔加入100μL一抗血清，37℃作用1h，PBST洗滌3次～5次，加入1：3 000倍稀釋的酶標(biāo)二抗羊抗雞IgG，100μL／孔，37℃作用1h，PBST洗滌3次～5次，以TMB顯色10min，最后加入2 mol／L的硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上以O(shè)D450nm讀數(shù)。

2.3.3 間接ELISA陰、陽(yáng)性臨界值的確定 用已建立的flic－ELISA方法檢測(cè)50份SPF雞腸炎沙門菌陰性血清，計(jì)算50份SPF雞腸炎沙門菌陰性血清OD450nm值的平均值（X）為0.103，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.047，按照公式：X＋3SD確定flic－ELISA的陰陽(yáng)臨界值為：0.243，即確定當(dāng)用flic－ELISA方法檢測(cè)時(shí)，OD450nm＞0.243可判斷為陽(yáng)性，OD450nm＜0.243則為陰性。

2.3.4 特異性試驗(yàn) 由表7可見(jiàn)腸炎沙門菌13株（SE28～CVCC3378）陽(yáng)性血清反應(yīng)的OD450nm值均大于0.243，flic－ELISA試驗(yàn)判定為陽(yáng)性，而其他菌 （毒 ）10 株 （S.typhi－NDV）陽(yáng) 性 血 清 反 應(yīng) 的OD450nm值均小于0.243，flic－ELISA 試驗(yàn)判定為陰性，說(shuō)明該flic－ELISA方法具有較好的特異性。

2.3.5 敏感性試驗(yàn) 用所建立的flic－ELISA方法檢測(cè)SE陽(yáng)性血清，結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋到1∶160時(shí)，OD450nm值高于臨界值，稀釋到1∶320時(shí)，OD450nm值低于臨界值。

表1 重組抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定Table 1 Determination of the optimum coating concentration of recombinant antigen and optimum serum dilution

表2 flic－ELISA檢測(cè)50份SE陰性血清結(jié)果（OD450nm）Table 2 The detection results of 50SE negative sera with flic－ELISA methods（OD450nm）

表3 flic－ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The specificity test results of flic－ELISA

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.6.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同批次抗原和試劑在3個(gè)不同的時(shí)間內(nèi)對(duì)20份陽(yáng)性血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，變異系數(shù)在1.7%～2.5%之間，均小于2.5%。

2.3.6.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 用不同批次抗原和試劑對(duì)20份陽(yáng)性血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，變異系數(shù)在2.1%～3.8%之間，均小于3.8%。

2.4 flic－ELISA方法的應(yīng)用

以flic－ELISA方法檢測(cè)90份廣西某雞場(chǎng)未接種過(guò)SE疫苗的血清樣品，結(jié)果顯示間接ELISA的檢出21份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.3%，說(shuō)明腸炎沙門菌普遍存在于雞群中。

3 討論

腸炎沙門菌鞭毛蛋白（flic）是腸炎沙門菌鞭毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白是H抗原蛋白，含有大量的抗原表位，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生腸炎沙門菌鞭毛蛋白的中和抗體，可以用重組鞭毛蛋白做抗原檢測(cè)抗體水平，本試驗(yàn)用腸炎沙門菌SE28經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的fliC基因片段在285bp左右，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切純化后克隆到PGEX－4T－1，獲得重組的表達(dá)質(zhì)粒pGEX－filC，經(jīng)誘導(dǎo)后重組蛋白大小約為37ku，以水溶性形式表達(dá)，純化后的filc重組蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)，驗(yàn)證重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以用作免疫原，本試驗(yàn)采用谷胱甘肽親和回收純化方法得到了純度較高的重組鞭毛蛋白，所純化的SE重組鞭毛蛋白可用于建立flic－ELISA方法的抗原。

本試驗(yàn)對(duì)ELISA方法的抗原包被量、血清和酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和作用時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化，確定了flic－ELISA 最佳操作程序，以0.01mg／mL pGEX－fliC蛋白為最佳包被濃度，確定了陰、陽(yáng)臨界值OD450nm值為0.243。本試驗(yàn)中腸炎沙門菌陽(yáng)性血清反應(yīng)的 OD450nm 值均大于0.243，flic－ELISA試驗(yàn)判定為陽(yáng)性，而其他血清型沙門菌13株的血清反應(yīng)的OD450nm值均小于0.243，flic－ELISA試驗(yàn)判定為陰性，說(shuō)明該flic－ELISA方法具有較好的特異性、敏感性。以建立的flic－ELISA方法檢測(cè)臨床血清樣品，結(jié)果顯示該間接ELISA的檢出率23.3%，說(shuō)明腸炎沙門菌普遍存在于雞群中。本試驗(yàn)建立的flic－ELISA敏感度高、特異性強(qiáng)及在短時(shí)間內(nèi)可以檢測(cè)大量的血清樣品，給臨床檢測(cè)腸炎沙門菌提供了一種可行的血清學(xué)檢測(cè)方法。

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