孫 艷 榮 容 張偉杰 曲榮鋒 金仙梅 夏大文 李玉林 遲寶榮(吉林大學第二醫(yī)院腫瘤血液內科，吉林 長春 00)

隨著我國飲食習慣和結構的改變以及人口老齡化，結直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢〔1〕，侵襲和轉移是結直腸癌死亡的主要原因。近年研究表明CXC族趨化因子CXCL12，又稱基質細胞衍生因子(SDF-1)，及其受體CXCR4在腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移中發(fā)揮著重要作用〔2〕。富含亮氨酸重復單位的G蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)在小腸和結腸隱窩基底柱狀上皮細胞特異性表達，經(jīng)研究證實其為小腸和結直腸干細胞標記物〔3，4〕。目前認為腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質性腫瘤細胞的細胞，為腫瘤生長、轉移和復發(fā)的根源〔5〕。因此本研究旨在探討人結直腸癌組織中趨化因子CXCL12/CXCR4生物軸及干細胞標志物lgr5基因的表達變化及其與臨床病理特征間的關系，從而探尋新的抗腫瘤治療靶點。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2011年1月至2011年12月在吉林大學第二醫(yī)院基本外科行手術切除的結直腸癌組織及遠端切緣部位正常組織標本各27例，術前均未行化療、放療等輔助治療;取離體30 min內的惡性腫瘤組織、遠端切緣部位正常組織，分別切取成直徑為0.2～0.5 cm的組織塊3塊，迅速浸入預先放置RNAsafeguard保存試劑的滅菌凍存管中，再轉入－80℃超低溫冰箱保存。術后組織病理學確診，根據(jù)第7版《AJCC腫瘤分期手冊》，27例結直腸癌患者中Ⅰ期4例，ⅡA期6例，ⅢA期1例，ⅢB期8例，ⅢC期3例，ⅣA期3例，ⅣB期2例。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol總RNA抽提試劑盒購自(德國QIGEN 公司)，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM均購自(日本TAKARA公司)，人淋巴細胞分離液購自(天津TBD公司)，RNAsafeguard保存試劑購自(杭州博日公司)，ABI7500 Fast Real-Time熒光定量PCR儀購自(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成 取冷凍保存的組織標本100～200 mg，參照試劑盒說明書步驟，采用Trizol法提取總RNA，對獲得的RNA采用紫外分光光度計測OD260和OD280值，按公式計算出RNA的濃度和純度。

取 1 μg總 RNA，加入5 × gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA E-raser 1 μl，RNase Free dH2O 使總反應體系為 10 μl，42℃ 2 min行基因組DNA的除去反應。之后冰上配制反應液，5×Prime-Script?Buffer 4 μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Prim-er Mix 1 μl，基因組 DNA 除去后的反應液 10 μl，加入 RNase Free dH2O 使總反應體系為 20 μl，37℃ 15 min，85℃ 5 s，合成的cDNA －20℃保存待用。

1.4 SYBR Green實時定量PCR檢測CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA表達 參照PrimerBank數(shù)據(jù)，由博仕生物公司合成CXCL12、CXCR4、lgr5及內參基因GAPDH引物，具體序列、產(chǎn)物大小及退火溫度如下，CXCL12基因:上游引物 5'-ACTGGGTTTGTGATTGCCTCTGAA-3'，下游引物 5'-GGAACCTGAACCCCTGCT GTG-3'，產(chǎn)物126 bp;CXCR4基因:上游引物:5'-CCTATGCAAGGCAGTCCATGT-3'，下游引物:5'-GGTAGCGGTCCAGACTGATGA-3'，產(chǎn)物86 bp;lgr5基因:上游引物5'-CACCTCCTACCTAGACCTCAGT-3'，下游引物:5'-CGCAAGACGTAACTCCTCCAG-3'，產(chǎn)物94 bp。內參基因GAPDH:上游引物:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，產(chǎn)物87 bp。退火溫度均為60℃。

取待測各樣品cDNA 2 μl，分別加入SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2 ×)12.5 μl，擴增基因上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，ROX Reference Dye(50 × )0.5 μl，dH2O 9 μl，總反應體系25 μl。除樣品管外，同時設置不加模板陰性對照管。將加樣管置于ABI7500FAST熒光定量PCR檢測槽內，打開軟件，設定檢測程序為:Relative Quantification(ddCt)Plate，檢測熒光為SYBR。實時熒光定量PCR反應條件:95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共進行40個循環(huán)，設置溶解曲線。每個cDNA樣本均重復檢測3次，無明顯差異的情況下取平均值。應用Relative Quantification(ddCt)Study定量分析軟件采用 2-△△Ct法對 CXCL12、CXCR4及 lgr5 mRNA表達行相對定量分析〔6〕。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用中位數(shù)(最小值，最大值)表示，CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA在不同組織間、臨床病理參數(shù)之間表達差異的統(tǒng)計學處理采用Wilcoxon、Kruskal-Wallis秩和檢驗。

2 結果

2.1 RNA抽提結果 提取的RNA經(jīng)瓊脂糖電泳，紫外投射儀下觀察，18 s和28 s條帶完整、明亮，28 s寬度約為18 s的2倍，OD260/OD280平均為1.8～2.0，表示抽提的RNA純度較高。

2.2 CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA實時定量PCR表達結果

CXCL12、CXCR4、lgr5及內參基因 GAPDH的 SYBR Green實時定量PCR產(chǎn)物顯示，熒光擴增曲線呈平滑的S型曲線，溶解曲線分析呈單一峰無非特異性熒光，表明PCR產(chǎn)物無非特異性擴增及DNA污染。

27例結直腸癌組織及27例匹配的遠端切緣部位正常組織中均檢測到CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA表達，癌組織中CXCR4、lgr5 mRNA表達均明顯高于正常組織，但CXCL12 mRNA在癌組織中表達下調，癌組織中表達明顯低于匹配正常組織，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.3 結腸癌組織中CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA表達與臨床病理特征的關系 27例結直腸癌患者中男性12例，女性15例。年齡≤60歲13例，＞60歲14例，平均年齡62歲。結腸癌11例，直腸癌16例。有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移15例。CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA在不同性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、大小、組織學類型組間表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但有淋巴結轉移組CXCR4、lgr5 mRNA表達高于無淋巴結轉移組，且有淋巴結轉移組CXCL12 mRNA表達下降更顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1 CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA在結直腸癌組織及匹配正常組織中的表達〔中位數(shù)(最小值，最大值)〕

表2 結直腸癌組織中CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA的表達與臨床病理特征的關系〔中位數(shù)(最小值，最大值)〕

3 討論

新近《自然》和《科學》雜志同期發(fā)表的3項涉及腦、皮膚及腸道腫瘤的研究，首次在原生環(huán)境中確定CSC的存在〔7～9〕。其中Schepers等〔7〕在小鼠腸道腺瘤模型中，通過譜系追蹤技術證實，可標記正常腸道腺窩干細胞的標志物lgr5，也同時出現(xiàn)在腺瘤細胞的一個亞群中。研究表明此類細胞約占5% ～10%，位于腺瘤基底部，于潘氏細胞間雜分布，是驅動腺瘤增長的關鍵。此項被稱之為“看見腫瘤干細胞”的研究為CSC作為治療靶點提供了確鑿的證據(jù)。

人類lgr5基因定位于染色體12q22～q23，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、生殖器官及胃腸道等均有表達。Wnt信號通路廣泛作用于機體生長發(fā)育過程，參與人體的胚胎發(fā)育、干細胞的增殖分化以及腫瘤的形成。lgr5作為Wnt信號通路中靶基因，當信號通路異常激活時，引起lgr5的表達顯著升高，可能對腸上皮細胞的惡性轉化起到重要作用。而研究也表明lgr5是小腸和結直腸干細胞標記物，推測如干細胞的Wnt信號通路異常激活后，引起靶基因lgr5的表達升高，可促進干細胞的增殖分化和惡性轉化。

根據(jù)腫瘤細胞基于趨化因子實現(xiàn)器官特異性轉移的理論〔10〕，不同的腫瘤高表達特異的趨化因子受體，而有些器官高表達其相應的趨化因子配體，腫瘤細胞利用趨化因子與其受體的特異性結合力，最終達成向這些器官的特異性轉移。趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構成的CXCL12/CXCR4生物學軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉移中發(fā)揮著重要作用〔2〕。高表達CXCR4的腫瘤細胞，可能在CXCL12趨化、牽引下，轉移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官，從而形成器官特異性轉移。

基于CSC是腫瘤復發(fā)及轉移的種子細胞，以及CXCL12/CXCR4生物學軸在腫瘤的播散和器官特異性轉移中的重要作用。筆者推測結直腸癌發(fā)生、發(fā)展進程中，如Wnt信號通路靶基因lgr5的表達升高，可促進結直腸干細胞的增殖分化和惡性轉化，此后在趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構成的CXCL12/CXCR4生物學軸作用下，實現(xiàn)結直腸癌的侵襲和轉移。

因此在本研究中，筆者采用SYBR Green實時定量PCR檢測54例結直腸癌組織、匹配的遠端切緣正常組織中CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA表達。結果顯示癌組織中l(wèi)gr5、CXCR4在mRNA轉錄水平表達明顯升高，且與淋巴結轉移相關。而CXCL12 mRNA在癌組織中表達低于匹配正常組織。癌組織中CXCR4 mRNA表達上調及CXCL12 mRNA表達下調，可促使細胞定向遷移至趨化因子濃度較高的組織器官。進一步統(tǒng)計學分析顯示有淋巴結轉移組CXCL12 mRNA表達下降更顯著，也佐證了CXCL12/CXCR4生物學軸在結直腸癌轉移中的作用。

腫瘤干細胞具有的自我更新能力和分化潛能、高致瘤性、耐藥性等生物學特點，決定CSC是手術、放化療等傳統(tǒng)治療失敗的主要因素。常規(guī)的腫瘤治療方法對處于相對靜止狀態(tài)的CSC起效甚微，反而藥物篩選、富集及殘存的CSC得以增殖，從而成為腫瘤復發(fā)及轉移的種子細胞。通過揭示CSC表面標記物，CSC中突變基因或異常信號傳導途徑等潛在治療靶點，方能更有效地靶向CSC〔11〕。本實驗結果顯示癌組織中 lgr5在mRNA轉錄水平表達明顯升高，且與淋巴結轉移相關，提示結直腸癌腫瘤干細胞參與腫瘤的發(fā)生及轉移。趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構成的CXCL12/CXCR4生物學軸在多種腫瘤的局部侵襲和器官特異性轉移中的作用也得以證實。因此通過CSC生物學性狀的揭示，CXCL12/CXCR4生物軸在腫瘤侵襲及轉移調控機制的進一步研究，預測CXCL12/CXCR4、lgr5有望成為抗腫瘤治療的新靶點。

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