林書(shū)坡 周更蘇(邢臺(tái)市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054000)

脂聯(lián)素(APN)具有改善胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN主要通過(guò)與其靶器官和組織上相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮其病理生理作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，APN與高血壓所致的心室重構(gòu)有密切關(guān)系，APN可能對(duì)心室重構(gòu)有抑制作用〔1〕。Yamauchi等〔2〕于2003年首次克隆出人類和小鼠脂聯(lián)素受體。APN主要有兩種受體:脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)。心肌組織主要表達(dá)AdipoR1〔3〕。目前，關(guān)于心肌組織AdipoR1與高血壓所致心室重構(gòu)研究較少。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)SHR大鼠心室重構(gòu)情況和心肌AdipoR1及其mRNA表達(dá)水平的變化研究，旨在探討AdipoR1在高血壓所致心室重構(gòu)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為實(shí)驗(yàn)組，相同周齡的雄性京都Wistar大鼠(WKY)為對(duì)照組，每組8只。體重(271±30)g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2007-0001。自由飲食，每?jī)芍軠y(cè)一次血壓和體重，12 w后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查及取材測(cè)定各指標(biāo)。

1.2 主要的試劑與儀器 兔抗大鼠AdipoR1多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)、Trizol Reagent(美國(guó) Invitrogen Life Technologies公司)、RT-PCR試劑盒和 DNA Marker(大連 TaKaRa公司)、PCR引物(北京華大基因公司合成)、凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生化有限公司)、硝酸纖維素膜(Millopore公司)、羥脯氨酸測(cè)定試劑盒和Masson染色試劑盒(南京建成生物公司)、Philips iE33型彩色多普勒超聲儀(Philips公司)、PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra)。

1.3 大鼠收縮壓的測(cè)量 應(yīng)用尾套式小動(dòng)物血壓測(cè)量計(jì)測(cè)定大鼠血壓，步驟如下:固定大鼠尾部，于白熾燈下照射加熱約10 min，使大鼠尾部血管擴(kuò)張后將尾部套于壓敏傳感器上。在大鼠清醒、安靜的狀態(tài)下，應(yīng)用生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)直接同步記錄尾動(dòng)脈壓力和脈搏曲線，當(dāng)出現(xiàn)第1個(gè)脈搏波時(shí)向尾套氣囊內(nèi)充氣，逐漸阻斷大鼠尾動(dòng)脈血流直至脈搏波完全消失，然后放氣至第1個(gè)脈搏波重新出現(xiàn)，此波所對(duì)應(yīng)的壓力值即為收縮壓。

1.4 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能 腹腔注射3%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉大鼠后，胸部備皮，仰臥位固定，略向左側(cè)傾斜，將探頭置于大鼠胸部正中位或略偏左對(duì)大鼠進(jìn)行超聲檢查，取得滿意的胸骨旁左心室長(zhǎng)軸二維圖像后，M型超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、舒張末期室間隔厚度(IVST)及左室后壁厚度(LVPWT)。調(diào)整脈沖多普勒掃描速度，將取樣容積放在二尖瓣與左室流出道之間描記多普勒血流頻譜圖，測(cè)定二尖瓣口舒張?jiān)缙诤褪鎻埻砥谘鱁峰、A峰峰值流速，計(jì)算E/A比值。

1.5 左心室重量指數(shù)(LVWI)的測(cè)量及心肌標(biāo)本的采集 采血后迅速取出心臟，生理鹽水沖洗殘血，濾紙吸干，去除大血管殘根和結(jié)締組織，沿房室交界處剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔和左心室，稱左心室重量。LVWI=左心室重量(mg)/體重(g)。切取部分左室游離壁心肌，4%多聚甲醛中固定備用。其余心肌置液氮罐中冷凍后，－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 心肌形態(tài)學(xué)觀察 心肌形態(tài)學(xué)觀察心肌組織HE染色，觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化。Masson染色，光鏡下觀察并拍片，用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。CVF=心肌膠原面積/所測(cè)視野面積，所有標(biāo)本均隨機(jī)取4個(gè)視野測(cè)量，取平均值。

1.7 羥脯氨酸(Hyp)含量測(cè)定 取凍存心肌100 mg，脫水，脫脂，將沉淀烘干并研成粉末。取20 mg干粉，加入6 mmol/L HCl 3 ml，放入試管中于95℃水浴20 min，冷卻后用6 mmol/L NaOH調(diào)pH值至6.0，加水至10 ml，3 500 r/min離心10 min。過(guò)濾取上清液，按照Hyp檢測(cè)試劑盒的要求檢測(cè)，計(jì)算Hyp含量。

1.8 RT-PCR方法檢測(cè)心肌組織AdipoR1 mRNA表達(dá) Trizol一步法提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算總RNA濃度和純度，將總RNA濃度經(jīng)DEPC處理的雙蒸水調(diào)整至1 μg/μl，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明，用 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)并合成大鼠AdipoR1引物，上游引物序列:5'-ATCCGCAGGTCAACG-3'，下游引物序列:5'-GGAGGAGGGCATAGGT-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度526 bp。選用β-actin為內(nèi)參照，上游引物序列5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'，下游引物序列5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度701 bp。擴(kuò)增條件為 94℃ 5 min，98℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上顯影照相，用凝膠成像分析軟件分析，計(jì)算AdipoR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。AdipoR1 mRNA表達(dá)量的相對(duì)值=AdipoR1基因擴(kuò)增條帶的灰度值/β-actin基因擴(kuò)增條帶的灰度值。

1.9 Western印跡方法檢測(cè)心肌AdipoR1蛋白的表達(dá) 取凍存心肌組織100 mg勻漿器勻漿，凱基全蛋白提取試劑盒提取心肌組織總蛋白質(zhì)，Bradford法蛋白定量，取標(biāo)本蛋白50 μl上樣，經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠(10%SDSPAGE)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃過(guò)夜。TBS洗膜5 min×3次，加入1∶400稀釋的AdipoR1兔抗大鼠多克隆抗體、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體，室溫下2 h。清洗:TTBS洗5 min×2次，TBS洗5 min×1次。酶顯法顯色劑顯色。掃描，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，測(cè)定各條帶灰度值，記錄結(jié)果。計(jì)算各蛋白帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 收縮壓變化 SHR組大鼠收縮壓隨周齡的增長(zhǎng)而逐漸升高，而WKY組收縮壓無(wú)顯著變化。兩組收縮壓在同一時(shí)期均具有顯著差異(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。SHR大鼠具有收縮壓持續(xù)升高的特點(diǎn)，是研究高血壓的理想動(dòng)物模型。

2.2 超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)的比較 與WKY組相比，SHR組IVST和LVPWT均增加，LVEDD和E/A值降均低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。各組大鼠左室壁及室腔各切面顯示較清晰。提示SHR大鼠心室肥厚和左室舒張功能有所降低。

2.3 LVWI的比較 SHR組大鼠LVWI明顯升高，與WKY組比較差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 心肌形態(tài)學(xué)的改變 WKY組大鼠心肌細(xì)胞大小及染色未見(jiàn)異常，排列規(guī)整;SHR組大鼠心肌纖維體積增大，染色相對(duì)不均勻，排列紊亂，心肌纖維，心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞肥大增生。見(jiàn)圖2。

2.5 心肌組織Masson染色及CVF的比較 Masson染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色。WKY組大鼠心肌間質(zhì)可見(jiàn)少量膠原，主要位于血管周圍。SHR組大鼠心肌組織中膠原明顯增多，呈柵欄狀排列緊裹心肌細(xì)胞。見(jiàn)圖3。SHR組CVF顯著高于WKY組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.6 心肌組織Hyp含量的比較 SHR組Hyp含量顯著高于WKY組(P＜0.05)。Hyp含量可反映心肌膠原含量，結(jié)果提示SHR大鼠心肌膠原增多。見(jiàn)表2。

表1 各大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較(n=8，±s)

表1 各大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 IVST(mm)LVPWT(mm)LVEDD(mm)E/A WKY組1.37±0.17 1.28±0.08 6.19±0.34 1.90±0.05 SHR組 1.67±0.191)1.53±0.161)5.24±0.211)1.52±0.111)

圖1 各組大鼠收縮壓水平的變化

圖2 心肌形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

圖3 心肌Masson染色(×400)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 LVWI(mg/g) CVF(%) Hyp(μg/g)WKY組2.59±0.09 3.17±0.31 326.4±37.5 SHR組 2.93±0.121) 6.25±0.291) 523.8±65.31)

2.7 心肌AdipoR1 mRNA表達(dá)的比較 SHR組心肌組織AdipoR1 mRNA表達(dá)(0.39±0.03)顯著低于 WKY組(0.78±0.06)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 RT-PCR分析AdipoR1 mRNA在心肌的表達(dá)

2.8 心肌AdipoR1蛋白表達(dá)的比較 與WKY組(0.73±0.26)相比，SHR組(0.37±0.03)心肌組織 AdipoR1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 Western印跡方法分析心肌組織AdipoR1蛋白表達(dá)

3 討論

APN是由Scherer等〔3〕于1995年在小鼠脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)。脂聯(lián)素主要在脂肪細(xì)胞表達(dá)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)機(jī)體多種組織均有表達(dá)。以往研究顯示，脂聯(lián)素具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN以內(nèi)分泌方式循環(huán)于血液中，通過(guò)與其靶器官和組織上相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮其病理生理作用。

2003 年，Yamauchi等〔2〕首次克隆出人類和小鼠脂聯(lián)素受體，并發(fā)現(xiàn)有2種APN受體:AdipoR1和AdipoR2。人和鼠AdipoR1基因有96.8%的同源性。AdipoR1主要表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞，對(duì)APN的球狀結(jié)構(gòu)域具有高親和力，但對(duì)全長(zhǎng)APN親和力低。而AdipoR2主要表達(dá)在肝細(xì)胞，對(duì)兩者具有中等親和力。此外，內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和受損血管內(nèi)皮細(xì)胞等均有APN受體的表達(dá)。有研究證明，AdipoR1和AdipoR2也存在于心肌細(xì)胞，其中以AdipoR1為主〔4〕。APN受體包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，但它們的N端在細(xì)胞內(nèi)，C端在細(xì)胞外，這與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)相反，因此APN受體可能不與G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用，而直接激活下游一些信號(hào)分子如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶而發(fā)揮作用。

最近越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，APN與高血壓發(fā)生密切相關(guān)。Matsubara等〔5〕研究表明，血漿APN的濃度在高血壓患者低于正常人群。Kubota等〔6〕發(fā)現(xiàn)APN敲除(KO)小鼠在動(dòng)脈受機(jī)械損傷后內(nèi)膜增生比野生小鼠嚴(yán)重，而感染攜帶有APN基因的腺病毒之后卻能完全扭轉(zhuǎn)動(dòng)脈內(nèi)膜的過(guò)度增生，證明脂聯(lián)素是內(nèi)生的血管保護(hù)者。越來(lái)越多的研究支持APN作為一種保護(hù)因子參與高血壓的發(fā)生。APN可能是通過(guò)調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能以及調(diào)節(jié)血脂等作用而對(duì)高血壓產(chǎn)生間接作用。

關(guān)于APN與高血壓靶器官損害方面的研究較少。Mitsuhashi等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)低脂聯(lián)素是左室肥厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Shibata等〔7〕研究也表明，在APN基因敲除小鼠，用壓力負(fù)荷方式極易誘導(dǎo)出心肌肥厚，增加死亡率。而將腺病毒攜帶的APN基因重新轉(zhuǎn)入體內(nèi)后可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)。Huang等〔8〕最新研究發(fā)現(xiàn)，APN和AdipoR1在體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細(xì)胞高度表達(dá)，APN對(duì)成纖維細(xì)胞增生有抑制作用。目前APN在高血壓心肌重構(gòu)中作用機(jī)制尚不清楚?？赡軝C(jī)制為高血壓時(shí)壓力負(fù)荷增加、交感神經(jīng)興奮等因素導(dǎo)致兒茶酚胺增多和RASS激活，這些神經(jīng)體液因子可以作用于脂肪細(xì)胞以及其他能分泌APN的組織細(xì)胞，使得脂聯(lián)素分泌減少，同時(shí)，下調(diào)心肌細(xì)胞膜上AdipoR1表達(dá)，從而使磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化激活減少〔7〕，使心肌能量代謝發(fā)生障礙及其對(duì)蛋白合成抑制作用減弱，導(dǎo)致高壓力負(fù)荷狀態(tài)下心室重構(gòu)的發(fā)生。目前，關(guān)于這一機(jī)制的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)24周齡SHR有心室重構(gòu)發(fā)生，SHR大鼠發(fā)生了左室心肌肥厚。另外，Hyp是機(jī)體膠原蛋白特有的一種氨基酸，除彈性蛋白含有少量羥脯氨酸(1%)外，幾乎所有Hyp都存在于膠原蛋白中。本研究提示心肌間質(zhì)發(fā)生一定程度的纖維化，心肌AdipoR1表達(dá)的下調(diào)可能與高血壓心室重構(gòu)有關(guān)。至于APN與AdipoR1結(jié)合后是通過(guò)AMPK信號(hào)通路還是其他的信號(hào)通路，或者各通路共同作用而在高血壓心室重構(gòu)發(fā)揮作用，尚不清楚，還有待更深入的研究。

隨著人們對(duì)APN及其受體在高血壓以及高血壓心室重構(gòu)發(fā)病機(jī)制中研究的不斷深入，人們將會(huì)逐漸認(rèn)清其作用機(jī)制，AdipoR1激動(dòng)劑有可能成為臨床新藥研發(fā)和高血壓及高血壓靶器官損害治療的新思路。

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3 Scherer PE，Williams S，F(xiàn)ogliano M，et al.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

4 Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced cellular hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression in infarcted heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;290(6):2409-16.

5 Matsubara M，Maruoka S，Katayose S.Inverse relationship between plasma adiponectin and leptin concentrations in normal-weight and obese women〔J〕.Eur J Endocrinol，2002;147(2):173-80.

6 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T，et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation〔J〕.J Biol Chem，2002;277(29):25863-6.

7 Shibata R，Ouchi N，Ito M，et al.Adiponectin-mediated modulation of hypertrophic signals in the heart〔J〕.Nat Med，2004;10(12):1384-9.

8 Huang D，Yang C，Wang Y，et al.PARP-1 suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)action of PPAR gamma in cardiac fibroblasts〔J〕.Cardiovasc Res，2009;81(1):98-107.