劉乃杰 梁華新 秦治剛 孫利波 房曉萱 趙叢海 朱慶三

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在不同來(lái)源的轉(zhuǎn)移性腫瘤中，Ezrin蛋白高表達(dá)〔1～3〕。相對(duì)于良性上皮組織膜頂端的表達(dá)，胞漿高表達(dá)的Ezrin與人類乳腺癌去分化、侵襲和不良預(yù)后有關(guān)〔4〕。應(yīng)用shRNA和Ezrin負(fù)調(diào)控區(qū)突變抑制 Ezrin功能，可阻止侵襲和早期轉(zhuǎn)移〔5～7〕。研究發(fā)現(xiàn)Ezrin基因過(guò)表達(dá)與兒童橫紋肌肉瘤和骨肉瘤臨床分期相關(guān)，移植瘤模型證實(shí)減少橫紋肌肉瘤或骨肉瘤細(xì)胞系Ezrin的表達(dá)可導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移減少〔8〕。神經(jīng)膠質(zhì)瘤因其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，使手術(shù)及放化療效果均不理想。Tynninen等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)Ezrin同樣在神經(jīng)膠質(zhì)瘤高表達(dá)，且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展相關(guān)，與組織學(xué)細(xì)胞類型和WHO腫瘤等級(jí)相關(guān)。但不同腫瘤等級(jí)、不同浸潤(rùn)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ezrin表達(dá)量不同的機(jī)制不清楚。本文對(duì)侵襲性不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251的Ezrin蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，擬尋找浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療尋求新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織RNA提取試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒，北京博邁德科技發(fā)展有限公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司;Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、Oligo d(T)15Primers、Random Primers、TaKaRa LA Taq?Hot Start Version、pMD?18-T vector、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ，寶生物工程(大連)有限公司;DEPC，Sigma公司。U251、U87細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Ezrin基因的引物:EF216:5'-CTCGAGCTATGCCGAAACCAATCAATGTCCG-3'，ER1976:5'-GAATTCTTACAGGGCCTCGAACTCGTCGATG-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)分析工具 Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast及 blastx)，EBI＞Tools＞Protein，SWISS-MODEL，SWISS-PDB Viewer。

1.3 方法

1.3.1 Transwell檢測(cè)U251和U87細(xì)胞的遷移侵襲能力 取100 μl Matrix gel加至 Transwell小室中，置 37℃，待其凝固。0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，吸取100 μl(含1×105個(gè)細(xì)胞)加至Matrix gel表面，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜底面的細(xì)胞。

1.3.2 Ezrin基因的釣取、克隆及鑒定 0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞1×107，用組織RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，定量后，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。反應(yīng)體系:10 × buffer 2 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μl，RNase Inhibitor(40 U)0.5 μl，Oligo d(T)15Primers 1 μl，Random Primers 1 μl，RNA 1 μg，M-MLV 1 μl，補(bǔ)加free-RNase H2O至20 μl。反應(yīng)條件:37℃ 1 h。取上述合成的cDNA PCR擴(kuò)增Ezrin基因，配制25 μl反應(yīng)體系:10倍緩沖液2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μl，引物 EF216(10 pmol/L)、ER1976(10 pmol/L)各 1 μl，TaKaRa LA Taq?Hot Start Version 0.5 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 16 μl。按下列條件進(jìn)行反應(yīng):94℃30 s，58℃ 2 min，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物并回收，進(jìn)行TA克隆。37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落搖菌，小量提取質(zhì)粒，XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定。

1.3.3 Ezrin基因測(cè)序及序列分析 選取陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。應(yīng)用Basic Local A-lignment Search Tool(nucleotide blast)分析所測(cè)得的序列，判斷其與GenBank登陸的序列的相似性。再應(yīng)用Local Alignment Search Tool(blastx)分析所測(cè)序列氨基酸變異情況。

1.3.4 U87和U251細(xì)胞Ezrin蛋白結(jié)構(gòu)分析及預(yù)測(cè) 應(yīng)用EBI＞Tools＞Protein和 SWISS-MODEL在線分析 U87和 U251細(xì)胞Ezrin蛋白功能、結(jié)構(gòu)域、空間結(jié)構(gòu)差異;應(yīng)用SWISS-PDB Viewer分析變異氨基酸的位置。

2 結(jié)果

2.1 Transwell檢測(cè)U251和U87細(xì)胞的遷移侵襲能力 Transwell檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，穿過(guò)膜底面的U87細(xì)胞為(35.5±6.89)個(gè)，明顯高于U251細(xì)胞〔(13.3±3.01)個(gè)〕(P＜0.001)。表明U87的遷移、浸潤(rùn)能力強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

2.2 U251和U87細(xì)胞系Ezrin基因的釣取、克隆及鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1 700 bp，與Ezrin基因的大小相符(圖2)。切膠回收該P(yáng)CR產(chǎn)物，TA克隆。應(yīng)用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳顯示在圖3a泳道10和12、圖3b泳道2在1 700 bp處有一DNA條帶，表明其質(zhì)粒為陽(yáng)性克隆載體。

2.3 Ezrin基因測(cè)序及序列分析 選取圖3中的陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，應(yīng)用Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast)分析顯示，所測(cè)得的U251和U87細(xì)胞Ezrin基因序列與GenBank登陸序列的相似性為99%，U251細(xì)胞Ezrin基因序列中有一個(gè)位點(diǎn)突變，U87細(xì)胞有5個(gè)位點(diǎn)。應(yīng)用 Local Alignment Search Tool(blastx)分析Ezrin氨基酸，U251細(xì)胞Ezrin第407位氨基酸變異，U87細(xì)胞Ezrin在第66、258、265和577位變異。

圖1 Transwell檢測(cè)U251和U87細(xì)胞的遷移侵襲

圖2 RT-PCR擴(kuò)增U251和U87細(xì)胞系Ezrin基因

圖3 XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定Ezrin基因的TA克隆

2.4 U87和 U251細(xì)胞 Ezrin蛋白功能、結(jié)構(gòu)分析 應(yīng)用EBI＞Tools＞Protein在線分析 U87和 U251細(xì)胞 Ezrin蛋白功能，與U87細(xì)胞 Ezrin匹配的蛋白有1 503個(gè)，與 U251細(xì)胞Ezrin匹配的蛋白卻有362個(gè)。Ezrin的結(jié)構(gòu)分析顯示，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中U87細(xì)胞Ezrin的數(shù)量多于U251細(xì)胞，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等級(jí)分類顯示的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)分級(jí)和分層分級(jí)相同。U 87細(xì)胞Ezrin的結(jié)構(gòu)域有45個(gè)，而U251細(xì)胞的Ezrin只有5個(gè)。

2.5 SWISS-MODEL建模分析變異氨基酸的位置 應(yīng)用SWISS-MODEL分析，U87細(xì)胞Ezrin的3D空間結(jié)構(gòu)有8處與U251細(xì)胞不同，QMEAN4評(píng)分U87細(xì)胞Ezrin低于U251細(xì)胞(表1)。SWISS-PDB Viewer顯示U87細(xì)胞 Ezrin第258、265位氨基酸相對(duì)位于空間結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)。

表1 Ezrin蛋白QMEAN4評(píng)分

3 討論

Ezrin是ERM家族成員之一。ERM蛋白質(zhì)是高度保守的〔10〕，從進(jìn)化上，不同種類動(dòng)物ERM都有著相同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由氨基末端FERM、富含α-螺旋區(qū)和含有F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(30個(gè)氨基酸)的羧基末端組成，這些結(jié)構(gòu)域的同源可達(dá)約76%。生化研究表明，ERM蛋白通過(guò)N-末端和C-末端約100個(gè)氨基酸稱為N-/C-ERMAD的結(jié)構(gòu)域相互作用，屏蔽其與肌動(dòng)蛋白和膜的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)ERM蛋白進(jìn)行負(fù)調(diào)控。X-射線顯示FERM結(jié)構(gòu)域由包括一個(gè)與羧基末端結(jié)合的折疊的PTB/PH/EVH1的三葉草狀排列的F1、F2和F3，掩蔽一個(gè)大的FERM結(jié)構(gòu)〔11〕。Li等〔10〕研究的最新數(shù)據(jù)表明豐富的α中央螺旋結(jié)構(gòu)與FERM的F1和F2的連接區(qū)的相互作用對(duì)屏蔽結(jié)合位點(diǎn)，特別是與磷酸肌醇結(jié)合的位點(diǎn)具有重要作用。表明任何ERM蛋白的調(diào)控因子結(jié)合α-螺旋區(qū)可能會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象的變化，因此，在激活過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)。ERM蛋白的激活是由信號(hào)傳導(dǎo)嚴(yán)格調(diào)控的。

越來(lái)越多的證據(jù)證明ERM蛋白在腫瘤進(jìn)展中的作用。基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析顯示Ezrin在各種人類和嚙齒動(dòng)物腫瘤中的表達(dá)與良性的組織對(duì)比顯著增加〔5，12～15〕。Ezrin在胞質(zhì)表達(dá)量增加與人類乳腺癌去分化、侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)〔3〕。并且在同一腫瘤的不同臨床分期，Ezrin的表達(dá)量顯著不同。大量研究證實(shí)Ezrin在腫瘤組織的激活、表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲，是受信號(hào)分子調(diào)控的〔16～18〕。本研究推測(cè)Ezrin蛋白在腫瘤組織中變異影響其自身結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移侵襲能力不同。因此，本研究對(duì)具有不同侵襲能力的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87的Ezrin蛋白功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析來(lái)加以證明。應(yīng)用Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast)分析顯示，U251和U87細(xì)胞Ezrin基因序列與GenBank登陸序列的相似性為99%，U251細(xì)胞Ezrin基因序列中有一個(gè)位點(diǎn)突變，U87細(xì)胞的有5個(gè)位點(diǎn)，均導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸變異，即U251細(xì)胞Ezrin第407位氨基酸變異，U87細(xì)胞Ezrin第66、258、265和577位變異。本研究表明U87細(xì)胞Ezrin氨基酸變異多于U251細(xì)胞，導(dǎo)致其功能、結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)不同，從而影響U87、U251細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力不同。

1 Cui Y，Wu J，Zong M，et al.Proteomic profiling in pancreatic cancer with and without lymph node metastasis〔J〕.Int J Cancer，2009;124(7):1614-21.

2 Belbin TJ，Singh B，Smith RV，et al.Molecular profiling of tumor progression in head and neck cancer〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2005;131(1):10-8.

3 Sarrió D，Rodríguez-Pinilla SM，Dotor A，et al.Abnormal ezrin localization is associated with clinicopathological features in invasive breast carcinomas〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2006;98(1):71-9.

4 Baumgartner M，Sillman AL，Blackwood EM，et al.The Nckinteracting kinase phosphorylates ERM proteins for formation of lamellipodium by growth factors〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(36):13391-6.

5 Yu Y，Khan J，Khanna C，et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators〔J〕.Nat Med，2004;10(2):175-81.

6 Khanna C，Wan X，Bose S，et al.The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis〔J〕.Nat Med，2004;10(2):182-6.

7 Elliott BE，Meens JA，SenGupta SK，et al.The membrane cytoskeleton crosslinker ezrin is required for metastasis of breast carcinoma cells〔J〕.Breast Cancer Res，2005;7(3):R365-73.

8 Niqqli V，Rossy J.Ezrin/radixin/moesin:Versatile controllers of signaling molecules and of the cortical cytoskeleton〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2008;40(3):344-9.

9 Tynninen O，Carpén O，J??skel?inen J，et al.Ezrin expression in tissue microarray of primary and recurrent gliomas〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2004;30(5):472-7.

10 Li Q，Nance MR，Kulikauskas R，et al.Self-masking in an intact ERM-merlin protein:an active role for the central alpha-helical domain〔J〕.J Mol Biol，2007;365(5):1446-59.

11 Arpin M，Chirivino D，Naba A，et al.Emerging role for ERM proteins in cell adhesion and migration〔J〕.Cell Adh Migr，2011;5(2):199-206.

12 Bruce B，Khanna G，Ren L，et al.Expression of the cytoskeleton linker protein ezrin in human cancers〔J〕.Clin Exp Metastasis 2007;24(2):69-78.

13 Song J，F(xiàn)adiel A，Edusa V，et al.Estradiol-induced ezrin over-expression in ovarian cancer:a new signaling domain for estrogen〔J〕.Cancer Lett，2005;220(1):57-65.

14K¨obel M，Langhammer T，Hüttelmaier S，et al.Ezrin expression is related to poor prognosis in FIGO stage I endometrioid carcinomas〔J〕.Mod Pathol，2006;19(4):581-7.

15 Elzagheid A，Korkeila E，Bendardaf R，et al.Intense cytoplasmic ezrin immunoreactivity predicts poor survival in colorectal cancer〔J〕.Hum Pathol，2008;39(12):1737-43.

16 Belkina NV，Liu Y，Hao JJ，et al.LOK is a major ERM kinase in resting lymphocys cytoskeletal rearrangement through ERM phosphorylation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(12):4707-12.

17 ten Klooster JP，Jansen M，Yuan J，et al.Mst4 and Ezrin induce brush borders downstream of the Lkb1/Strad/Mo25 polarization complex〔J〕.Dev Cell，2009;16(4):551-62.

18 Chirivino D，Del Maestro L，F(xiàn)ormstecher E，et al.The ERM proteins interact with the class C-Vps/HOPS complex to regulate the maturation of endosomes〔J〕.Mol Biol Cell，2011;22(3):375-85.