吳敏霞 謝捷明 周琳瑛 (福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系電鏡室，福建 福州 350004)

正常生理?xiàng)l件下，大腦中tau蛋白存在于神經(jīng)元的軸突中，可促進(jìn)微管蛋白聚集成微管并增強(qiáng)其穩(wěn)定性、維持細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，且在神經(jīng)系統(tǒng)的形成和軸突的通訊傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用〔1〕。褪黑素(MLT)為體內(nèi)松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學(xué)結(jié)構(gòu)為 N-乙酰-5-甲氧基色胺，現(xiàn)可人工合成。MLT具有某些重要的神經(jīng)精神作用，如抗衰老、催眠、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、腦細(xì)胞損傷保護(hù)等作用。在AD患者，tau蛋白被異常過度磷酸化。課題組前期的研究也證明OA作用于NG108-15細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞Ser-396位點(diǎn)磷酸化tau蛋白表達(dá)增高，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細(xì)胞模型〔2〕。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞免疫化學(xué)及細(xì)胞免疫印跡技術(shù)觀察MLT對(duì)此AD樣細(xì)胞總tau蛋白水平的影響，進(jìn)而明確褪黑素對(duì)AD樣細(xì)胞的拮抗作用，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 岡田酸(OA)為Sigma公司產(chǎn)品，用DMSO配成20 μmol/L的母液，分裝備用。鼠抗tau蛋白單克隆抗體(Tau-5)，Neomarkers公司產(chǎn)品。Marker，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品。大鼠神經(jīng)母細(xì)胞和小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的雜交細(xì)胞系NG108-15細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NG108-15細(xì)胞用含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞間隙變得較明顯，細(xì)胞突起有所回收時(shí)終止消化，1640培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，3～4 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 利用總tau蛋白的抗體(Tau-5)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ABC方法)顯示總tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

1.2.3 Western印跡法 細(xì)胞勻漿制備:將種在6孔板上的細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液60 μl，裂解20 min，用自制的刮匙刮下，于4℃，離心10 min，吸取上清蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1.2.4 蛋白條帶密度分析法 采用ImageMaster?VDS凝膠成像及分析系統(tǒng)，于可見光下采集膜上的蛋白條帶圖像，通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶密度相比較，計(jì)算各條帶密度相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 見圖1，OA 10 nmol/L作用于NG108-15細(xì)胞6 h，加入MLT預(yù)處理，MLT濃度為100 μmol/L，提前1 h作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MLT處理組較模型組細(xì)胞總tau蛋白表達(dá)增高，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞漿和軸突的染色與對(duì)照組相比明顯變濃，提示MLT可增高AD樣細(xì)胞總tau蛋白水平。

圖1 MLT對(duì)NG108-15擬AD樣細(xì)胞總tau蛋白表達(dá)的影響(DAB，×400)

圖2 MLT對(duì)NG108-15擬AD樣細(xì)胞總tau蛋白表達(dá)的影響

2.2 細(xì)胞免疫印跡 圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MLT各處理組細(xì)胞總tau蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示MLT可明顯提高細(xì)胞總tau蛋白的表達(dá)。與模型組比較，低劑量MLT處理組細(xì)胞tau蛋白總水平表達(dá)明顯增加。結(jié)合條帶密度分析法，模型組、低劑量MLT處理組、高劑量MLT處理組各條帶密度值分別為0.012±0.008，0.085±0.013(P＜0.01)，0.074±0.008(P＜0.01)，低劑量與高劑量MLT處理組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

AD病是由多種因素引起的一種病理過程，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)是其典型的組織病理學(xué)改變。NFT由成對(duì)螺旋絲(PHF)組成，PHF的主要是由異常磷酸化tau蛋白的微管結(jié)合區(qū)的自我結(jié)合所導(dǎo)致的。

AD腦內(nèi)的神經(jīng)元的蛋白激酶系統(tǒng)和磷酸酯酶系統(tǒng)之間的失衡被認(rèn)為是tau蛋白過度磷酸化的原因。OA是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。NG108-15細(xì)胞系，它是小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的融合雜種系，朱粹青等〔3〕用OA誘導(dǎo) NG108-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NG108-15細(xì)胞發(fā)生了tau蛋白的過度磷酸化。課題組前期的研究也證明OA作用于NG108-15細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞ser-396位點(diǎn)tau蛋白過度磷酸化，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細(xì)胞模型〔2〕。

細(xì)胞內(nèi)總tau蛋白包括磷酸化tau蛋白和非磷酸化tau蛋白，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，MLT使模型組細(xì)胞總tau蛋白水平明顯提高，前期研究顯示 MLT使其磷酸化tau蛋白水平降低〔2〕，推論出MLT能增高AD樣細(xì)胞非磷酸化tau蛋白水平，表明MLT能通過提高非過度磷酸化tau蛋白的表達(dá)來維持tau蛋白的正常功能，促進(jìn)微管組裝與維持正常軸漿流，保證神經(jīng)元功能的正常運(yùn)行;本文結(jié)果說明MLT對(duì)總tau蛋白的作用與劑量不成比例。

在AD細(xì)胞模型中，用MTL進(jìn)行預(yù)處理，研究總tau蛋白和磷酸化tau蛋白表達(dá)的變化，可以推斷出非磷酸化tau蛋白的量的變化，明確該藥物的拮抗作用。在此基礎(chǔ)上，研究tau基因等多種基因的表達(dá)與變化，可進(jìn)一步在基因水平上探討其發(fā)病機(jī)制和MLT的拮抗途徑，也能為篩選抗AD的其他藥物研究提供參考依據(jù)。

1 吳 琪.Alzheimer病神經(jīng)原纖維纏結(jié)tau蛋白研究〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2000;26(1):63-4.

2 吳敏霞，許 盈，謝捷明，等.褪黑素對(duì)岡田酸致NG108-15細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化的影響〔J〕.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006;40(4):338-40.

3 朱粹青，曹小定.調(diào)心方藥物血清對(duì)動(dòng)物阿爾茨海默病相關(guān)的tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001;21(11):834-6.