王 暖 耿德勤 黃紅莉 周 昊 楊秀華 (徐州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 22002)

衰老與海馬細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)元存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化有著密切聯(lián)系，但眾說不一。磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)-AKt-Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡、存活、增殖以及細(xì)胞骨架的變化等活動中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，其中尤為重要的是它對細(xì)胞凋亡、存活的調(diào)節(jié)作用〔1，2〕。而老年大鼠是否存在 PI3K-AKt-Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的障礙，尚不十分清楚。本研究探討老年大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡、PI3K-AKt-Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑和儀器 健康SD大鼠:青年鼠(8月齡，200～250 g)，老年鼠(24月齡，450～500 g)各8只，雌雄各半，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Caspase-9 P35抗體、PI3K P85抗體、AKt抗體、p-AKt(ser473)抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司，p(Tyr)-PI3K P85抗體購自美國cell signaling公司，Y型迷宮、免疫組化試劑盒和TUNEL試劑盒均購自國內(nèi)。

1.2 學(xué)習(xí)記憶能力測試 兩組大鼠分別進(jìn)行Y型迷宮實(shí)驗(yàn)。連續(xù)10次電擊中有9次正確為達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，記錄動物達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所需電擊的次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)快慢程度的指標(biāo)，24 h后重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)過程，觀察大鼠的記憶能力。

1.3 TUNEL染色和免疫組化染色 Y迷宮測試24 h后留取8只(每組4只)大鼠麻醉，仰臥于固定臺上，暴露心臟，經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水100～150 ml，再灌注4℃4%多聚甲醛300 ml，然后斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處以冠狀切面切開鼠腦留取中間切塊，入4%多聚甲醛中后固定24～48 h，然后按以下程序進(jìn)行:固定后組織塊經(jīng)流水沖洗1～1.5 h，80%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，每一組織塊作5 μm的連續(xù)切片，貼于載玻片，60℃ ～70℃烤片6 h以上以備TUNEL法染色和免疫組化染色。染色方法按試劑盒說明書進(jìn)行。在400倍鏡下左側(cè)海馬區(qū)隨機(jī)取5個不重疊的視野進(jìn)行TUNEL、p-PI3K P85、p-AKt和Caspase-9 P35陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)(個/視野)，結(jié)果取5個視野的平均值。

1.4 Western印跡 余8只大鼠冰浴上斷頭取腦，剝離雙側(cè)海馬進(jìn)行組織勻漿;離心15 min;取上清用lowary法測蛋白含量;分裝，－20℃凍存?zhèn)溆?取30 μl蛋白在SDS-PAGE膠中電泳;之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至NC膜;取出膜后用BSA封閉室溫下振搖3 h，以阻斷非特異性結(jié)合;再分別加入1∶200稀釋的一抗(p-PI3K P85、P-AKt、PI3K P85、AKt、Caspase-9 P35)4℃ 孵育過夜;反應(yīng)完后二抗溫育2 h，AP顯色系統(tǒng)顯色。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力比較 與青年大鼠相比，老年大鼠學(xué)習(xí)嘗試次數(shù)明顯增加，記憶正確次數(shù)明顯減少，差異均有極顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力比較(± s，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別 學(xué)習(xí)嘗試次數(shù)(次) 記憶正確次數(shù)(次)青年組50.0±6.3 7.7±0.5老年組 75.0±5.51) 4.0±0.91)

2.2 大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)比較 青年大鼠海馬區(qū)未見TUNEL陽性神經(jīng)元。老年大鼠可見到較多TUNEL陽性神經(jīng)元(36.3±1.1)，其細(xì)胞核固縮深染，呈現(xiàn)棕黃色，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見圖1。

2.3 免疫組化染色結(jié)果 青年組海馬區(qū)可見較多p-PI3K、p-AKt陽性表達(dá)細(xì)胞，其染色深，胞漿著色呈棕黃色。老年組海馬區(qū)陽性表達(dá)細(xì)胞明顯減少，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。青年組海馬區(qū)偶見Caspase-9P35陽性神經(jīng)元。老年組海馬區(qū)可見較多Caspase-9P35陽性表達(dá)細(xì)胞，其染色深，棕黃色顆粒主要沉積在胞核周圍，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見表2，圖2～圖4。

圖2 大鼠海馬P-PI3表達(dá)(DAB，×400)

圖3 大鼠海馬p-AKt表達(dá)(DAB，×400)

圖4 大鼠海馬Caspase-9P35表達(dá)(DAB，×400)

表2 兩組大鼠海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經(jīng)元數(shù)比較(±s，n=4，個/視野)

表2 兩組大鼠海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經(jīng)元數(shù)比較(±s，n=4，個/視野)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別p-PI3K陽性神經(jīng)元p-AKt陽性神經(jīng)元Caspase-9p35陽性神經(jīng)元青年組36.0±2.6 24.0±2.9 7.0±1.8老年組 9.4±2.01) 8.7±1.11) 25.5±2.41)

2.4 Western印跡結(jié)果 與青年組相比，老年組海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt的活性明顯降低，Caspase-9p35蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);PI3K、AKt蛋白表達(dá)在兩組之間變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖5 兩組大鼠海馬組織p-PI3K、PI3K、p-AKt、AKt及Caspase-9p35蛋白表達(dá)

3 討論

近年來在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)迅速發(fā)展的推動下衰老機(jī)理的研究已取得了重大進(jìn)展，其中最具有代表性的學(xué)說有:自由基學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說和基因?qū)W說〔3，4〕。大量資料顯示，衰老大鼠不但出現(xiàn)基底前腦膽堿能神經(jīng)元的丟失、海馬的膽堿能纖維減少和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性下降，而且出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。在本研究中，使用Y型電迷宮評價了老年鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)嘗試次數(shù)明顯增多，記憶正確次數(shù)明顯減少，結(jié)果表明老年大鼠發(fā)生了嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙。

有證據(jù)表明，在老化過程中存在著神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為一些部位神經(jīng)細(xì)胞的減少、細(xì)胞對外界刺激不可修復(fù)的生物學(xué)反應(yīng)和細(xì)胞不能夠?qū)ι嫘盘柶鸱磻?yīng)最終導(dǎo)致死亡的一種生物學(xué)過程〔5〕等。衰老機(jī)體生長因子合成降低、跨膜信號缺陷、控制細(xì)胞增殖的特殊基因表達(dá)缺陷，不能對付氧化應(yīng)激，使得衰老機(jī)體易于激發(fā)凋亡過程〔6〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)生長因子(NGF)等因子與其相應(yīng)受體結(jié)合〔7〕，啟動PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過PI3K-Akt-caspase-9通路，使神經(jīng)元存活并維持正常功能。PI3K/AKt通路是一個公認(rèn)的細(xì)胞存活通路，介導(dǎo)多種生長因子的生物學(xué)效應(yīng)，如促細(xì)胞存活、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促細(xì)胞生長等〔8～10〕，是抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要信號途徑〔11，12〕。caspase-9 是活化的 AKt主要下游靶蛋白，完整的caspase-9即procaspase-9為46 000多肽是沒有活性的前蛋白，激活后裂解為37000或35000的活性片段〔13〕。本實(shí)驗(yàn)檢測的就是有活性的片段caspase-9 p35。Perianayagam等〔14〕注意到，C5a處理的中性粒細(xì)胞中caspase-9活性在加入PI3K抑制物Wortmannin后顯著提高。當(dāng)各種原因引起神經(jīng)存活因子減少或損傷性因素增加時，對信號傳導(dǎo)通路的刺激減弱，使多種維持神經(jīng)元存活的重要蛋白不能隨之激活，由此引起神經(jīng)元功能減退和細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響大鼠的認(rèn)知功能〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明老年大鼠海馬神經(jīng)元存在著PI3K-Akt-caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的障礙，可能是導(dǎo)致老年大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、學(xué)習(xí)記憶功能衰退的重要機(jī)制。

總之，老年鼠在衰老過程中，由于PI3K-Akt-caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的障礙，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，由于海馬是動物學(xué)習(xí)、記憶的重要神經(jīng)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)〔16〕，故導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。

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