王 濤 馬曉靜 李春梅 張興華 (山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250021)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的基本病變，而冠狀動(dòng)脈鈣化(CAC)則是其標(biāo)志和早期征象之一，檢測CAC并作分析，對于發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的存在，并在一定范圍內(nèi)提示硬化程度有著重要臨床意義〔1〕。visfatin是Fukuhara等〔2〕于2005年發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪因子，能發(fā)揮類似于胰島素的作用，降低血糖〔3〕;并能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的合成和儲(chǔ)積〔4〕。目前關(guān)于visfatin基因多態(tài)性的研究尚少。本研究擬觀察血清visfatin濃度及 rs61330082與rs2058539基因位點(diǎn)在山東省漢族人群當(dāng)中是否存在遺傳變異，及與CAC的發(fā)病是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實(shí)驗(yàn)組:選擇2010年9月至2012年3月期間于山東省立醫(yī)院心血管中心住院患者且經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查明確診斷為CAC共138例患者，均為漢族人群，相互間無血緣關(guān)系。MCG:男，40例，女26例，共66例，平均年齡(60.78±9.31)歲;MSCG:男，45例，女 27例，共 72例，平均年齡(65.98±12.87)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①糖尿病;②近1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)急慢性感染;③3個(gè)月內(nèi)外科手術(shù)，創(chuàng)傷;④慢性結(jié)締組織病及心臟瓣膜等疾病患者;⑤腫瘤;⑥嚴(yán)重肝腎功能不全。冠狀動(dòng)脈造影方法:采用經(jīng)右股動(dòng)脈Judkins方法，每一支血管至少有2個(gè)以上體位投影，結(jié)果由多年從事介入治療的有經(jīng)驗(yàn)的主任醫(yī)師判斷。CAC的診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)鈣化的嚴(yán)重程度，可分為以下4級(jí)〔5〕:無鈣化:未發(fā)現(xiàn)任何陰影;輕度鈣化:只有在心臟跳動(dòng)時(shí)看到很輕，模糊的跳動(dòng)的陰影，心臟不跳動(dòng)時(shí)完全看不到陰影的存在;中度鈣化:在心臟跳動(dòng)時(shí)看到較清楚、較容易看到的陰影;心臟不動(dòng)時(shí)看不到陰影的存在;重度鈣化:在心臟跳動(dòng)和不動(dòng)時(shí)均可清楚地看到陰影的存在。對照組:68例均行冠狀動(dòng)脈造影檢查，檢查方法同上，排除CAC，及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化且肝腎功能、心臟彩超及心電圖均正常。男40例，女28例，平均年齡(64.73±9.98)歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems9700型基因擴(kuò)增儀);圖像分析儀(AlphalmagerTm2200);低溫高速離心機(jī)(美國基因有限公司);電泳儀(北京六一儀器廠)人類基因組DNA提取盒(TIANGEN)，限制性內(nèi)切酶(Fermentas及 NEB)。

1.2.2 標(biāo)本采集及DNA的提取 所試對象均為冠脈造影術(shù)后明確診斷患者，均禁食12 h，過夜后于次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，取全血2 ml用人類基因組DNA提取試劑盒提取外周靜脈血白細(xì)胞，嚴(yán)格按照血液基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA，提取DNA于－80℃冰箱凍存，剩余全血于離心機(jī)3 000 r/min，離心10 min后取上清，于－80℃冰箱凍存，以檢測血清visfatin的濃度。

1.2.3 血清visfatin濃度的測定 血清visfatin檢測選用Blue-Gene公司提供visfatin檢測試劑盒，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行visfatin的檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，由Alisei全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)分析。

1.2.4 目的基因擴(kuò)增(PCR反應(yīng)) 引物通過生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)并合成，rs61330082位點(diǎn)上游引物:CCGGTAAAACACAGGGAAGAT， 下 游 引 物:ATTCTATCTGGGGGCAGTGAT。rs2058539位點(diǎn)上游引物 TTAACTTTGGTATTCTTGCCACT，下 游 引 物 CAAAAATCCCCCAATTTCTGT。PCR 反應(yīng)條件:反應(yīng)體系均為 50 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶0.25 μl;10 × pcr Buffer 5 μl模板 DNA1 μl，ddH2O 補(bǔ)充體積至50 μl。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入主循環(huán)(94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)×35 個(gè)循環(huán)，72℃終末循環(huán)5 min，置4℃終止反應(yīng)。取5 μl的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 μl上樣緩沖液在與1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得產(chǎn)物長度分別為 344 bp，273 bp。見圖 1。

1.2.5 酶切反應(yīng) PCR產(chǎn)物體系30 μl酶切體系，限制性內(nèi)切酶 MvaI 1.0 μl;10 × FastDigest Green Buffer 2.0 μl;rs66130058位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物 10 μl;ddH2O 17 μl補(bǔ)充體積至30 μl，離心均勻后，置37℃水浴充分酶解10 min。限制性內(nèi)切酶 HphI 0.5 μl;10 × NEB 緩沖液 2.0 μl;rs2058539 位點(diǎn) PCR產(chǎn)物 10 μl;ddH2O7.5 μl補(bǔ)充體積至 20 μl，離心均勻后，置37℃水浴充分酶解20 min。

1.2.6 酶切產(chǎn)物鑒定 取6 μl已含上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物，加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，以DNA marker為參照。于110 W電壓電泳后，在凝膠成像儀下觀察基因并照相。見圖2～圖5。

1.2.7 生化指標(biāo) 全自動(dòng)生化分析儀檢測血脂，血糖，C-反應(yīng)蛋白等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均以±s表示，單本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。所有顯著性檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。

圖1 visfatin基因不同位點(diǎn)PCR產(chǎn)物

圖2 visfatin基因rs61330082位點(diǎn)CT型

圖3 visfatin基因rs2058539、rs61330082位點(diǎn)CC、TT型

圖4 visfatin基因rs20585391位點(diǎn)AA型

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較 年齡、性別、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、C-反應(yīng)蛋白相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組血清Visfatin濃度的比較 MSCG患者的血清visfatin顯著高于 CCNCG〔(32.33±9.45)vs(25.48±3.28)ng/ml，P＜0.01〕。MSCG患者的血清 visfatin水平顯著高于 MCG〔(26.12±0.57)ng/ml，P＜0.01〕，MCG 與 CCNCG 無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 兩個(gè)基因位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較 基因位點(diǎn)rs61330082的基因型頻率及等位基因頻率分布有顯著性差異(P＜0.01)而rs2058539的基因頻率及等位基因頻率分布無顯著性差異(P＞0.05);位點(diǎn)rs61330082的T等位基因突變頻率顯示，T等位基因在CCNCG，MCG及MSCG是逐漸降低的趨勢。見表2，表3。

圖5 visfatin基因rs61330082位點(diǎn)CC型

表1 一般臨床資料比較(±s)

表1 一般臨床資料比較(±s)

一般臨床資料CCNCG MCG MSCG性別(男/女) 68(40/28) 66(40/26) 72(45/27)年齡(歲) 64.73±9.98 60.78±9.31 65.98±12.87 FBG(mmol/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08 LDL-C(mmol/L) 2.76±0.78 2.96±1.37 2.56±0.98 HDL-C(mmol/L) 1.07±0.54 1.10±0.36 0.97±0.85 TG(mmol/L) 1.17±0.45 1.92±0.83 1.97±0.97 C-反應(yīng)蛋白(mg/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08尿素氮(mmol/L)5.26±1.78 6.25±0.1.83 6.29±2.32

表2 兩個(gè)基因位點(diǎn)基因頻率的比較〔n(%)〕

表3 兩個(gè)基因位點(diǎn)等位基因頻率的比較〔n(%)〕

2.4 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)人群的基因型分布與H-W平衡的理論相符合，樣本具有群體代表性。

3 討論

visfatin是一種在內(nèi)臟脂肪組織中的高度表達(dá)的細(xì)胞因子，具有煙酰胺磷酸酶糖轉(zhuǎn)移酶的活性(NAMPT)，因其作為從骨髓基質(zhì)細(xì)胞中激活的淋巴細(xì)胞分泌的蛋白而被人們所認(rèn)識(shí)，其染色體位于7q22.1和7q31.33之間，長37.4 kb，由10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子構(gòu)成〔6〕。visfatin結(jié)構(gòu)呈結(jié)晶狀，可受激素類、噻唑烷二酮類藥物的調(diào)節(jié)。visfatin對機(jī)體的急性效應(yīng)包括保護(hù)缺血再灌注損傷的心肌，發(fā)揮類胰島素降低血糖水平的作用;慢性效應(yīng)為促內(nèi)皮細(xì)胞激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，抗凋亡等作用。Chang等〔7〕研究證實(shí)visfatin通過NF-KB和PI3K途徑有促進(jìn)血管新生的作用。還有證據(jù)表明〔8〕，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的急慢性冠狀動(dòng)脈疾病中，visfatin水平較健康對照組明顯升高，是獨(dú)立于其他冠心病的危險(xiǎn)因素。Garten等〔9〕發(fā)現(xiàn)，visfatin水平與低密度脂蛋白呈正相關(guān)，與甘油三酯呈負(fù)相關(guān)，在肥胖的代謝綜合征患者中，與空腹血糖和甘油三酯呈正相關(guān)，與低密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)〔10〕。Berndt等〔11〕報(bào)道visfatin基因啟動(dòng)子的-4689G/T基因多型性對血脂、肥胖和胰島素抵抗水平有影響。在純合子TT基因型中血清visfatin濃度高低與肥胖程度，體重指數(shù)，空腹胰島素相關(guān)，而在GG基因型中，只與空腹胰島素相關(guān)。

以上研究均為visfatin在各系統(tǒng)中發(fā)揮的作用。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于visfatin濃度與CHD相關(guān)性的研究頗多，但對visfatin的基因多態(tài)性研究甚少，尤其是與CAC的相關(guān)性研究更是少見?，F(xiàn)在CAC被用于CHD風(fēng)險(xiǎn)的評估已被越來越多的專家所認(rèn)可，認(rèn)為CAC的進(jìn)展可加重粥樣斑塊的形成，還與CHD患者的不良愈后有著必然聯(lián)系〔12〕。CAC不僅與CHD診斷密切相關(guān)，而且CAC嚴(yán)重程度與冠狀動(dòng)脈狹窄程度有較高的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)說明血清visfatin濃度在MSCG患者中是發(fā)揮一定作用的，visfatin濃度越高，冠狀動(dòng)脈越發(fā)生嚴(yán)重鈣化，visfatin水平高低與CAC程度呈正相關(guān)。位點(diǎn)rs2058539SNP雖存在遺傳突變，但是與CAC發(fā)展可能沒有相互關(guān)聯(lián)性。

冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來的分子生物學(xué)研究CHD的發(fā)病機(jī)制與基因多態(tài)性相關(guān)，例如Apo-I，ACEI基因多態(tài)性等〔13〕，相關(guān)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)都與CHD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本研究揭示了中國山東漢族人群中冠狀動(dòng)脈鈣化的發(fā)病與血清visfatin及其基因位點(diǎn)rs61330058及rs2058539多態(tài)性相關(guān)情況。CAC患者血清visfatin濃度升高，能在一定程度上反應(yīng)血管內(nèi)皮功能破壞情況和CAC的嚴(yán)重程度，提示血清visfatin水平與CAC發(fā)展密切相關(guān)。而基因研究提示visfatin rs61330058 SNP的T等位基因突變多態(tài)性與CAC的相關(guān)性，證實(shí)T基因具有保護(hù)心血管的作用，即存在基因突變后T基因的人群，其患CAC的概率就降低。目前診斷冠心病的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是冠狀動(dòng)脈造影，此診斷方法造價(jià)高，患者住院時(shí)間長，并且為有創(chuàng)性檢查，病人一般難以接受。本實(shí)驗(yàn)的臨床意義即通過血清visfatin濃度和基因型的檢測可以篩查CHD的高危人群，為冠心病患者動(dòng)脈硬化程度的預(yù)測及開發(fā)新的藥物提供理論基礎(chǔ)，有助于早期發(fā)現(xiàn)和防治CHD。本實(shí)驗(yàn)還有一些不足之處，只做了2個(gè)基因位點(diǎn)的研究，其中位點(diǎn)rs2058539并沒有做出與CAC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，考慮是否與樣本量小有關(guān)系。如果要揭示多個(gè)基因位點(diǎn)與冠心病之間的關(guān)系，還需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行綜合性的研究。

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