潘曉花 王夢芝 付 聰 王洪榮

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

在當(dāng)前集約化飼養(yǎng)模式下，為了提高動物的生產(chǎn)效率而大量飼喂以淀粉為主要能源的高精料飼糧，使得亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)等代謝性疾病的發(fā)病率升高，而防治瘤胃酸中毒的傳統(tǒng)措施主要是控制飼糧中淀粉等精料的比例或添加碳酸氫鈉等堿類物質(zhì)[1]，以及添加莫能菌素等抗生素以抑制瘤胃微生物產(chǎn)乳酸[2]，但碳酸氫鈉只能暫時緩解酸中毒，而很多抗生素會抑制纖維降解菌對粗飼料的降解并存在安全問題，這使得抗生素逐漸被禁用，因此尋求一種安全高效的緩解瘤胃酸中毒的途徑具有重要意義。最新的一些研究表明:瘤胃微生物硫胺素代謝與瘤胃酸中毒有密切關(guān)系，向高精料飼糧中添加硫胺素能提高瘤胃液pH，降低乳酸、組胺及內(nèi)毒素濃度，以緩解瘤胃酸中毒[3-5]。而瘤胃酸中毒得以緩解的根本原因是瘤胃微生物中乳酸利用菌和乳酸產(chǎn)生菌的比例逐漸恢復(fù)平衡，但有關(guān)硫胺素調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在采用人工瘤胃法研究不同精粗比飼糧對硫胺素微生物凈合成量的影響，以及添加硫胺素對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期揭示硫胺素緩解亞急性瘤胃酸中毒的根本原因，為硫胺素在反芻動物中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼糧

為了減少體外直接誘導(dǎo)亞急性瘤胃酸中毒及體內(nèi)飼糧因素造成的影響，本試驗(yàn)采用體內(nèi)初步誘導(dǎo)奶牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒與體外培養(yǎng)相結(jié)合的研究方法。試驗(yàn)選用3頭安裝永久性瘤胃瘺管、體重為(650±20)kg、平均日產(chǎn)奶量為(16.5±0.5)kg、身體健康狀況良好的4歲齡荷斯坦奶牛。每天于06:00和18:00按奶牛體重2%的干物質(zhì)量等量飼喂，自由飲水。試驗(yàn)分為4期，每期飼喂 10 d，依次飼喂精粗比為 40∶60、50∶50、60∶40、70∶30 的試驗(yàn)飼糧，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)第 4期飼喂結(jié)束后亞急性瘤胃酸中毒誘導(dǎo)成功。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 體外培養(yǎng)試驗(yàn)方法

1.2.1 體外發(fā)酵裝置

參照Menke等[6]的方法安裝人工瘤胃裝置，由恒溫振蕩水浴鍋和具3孔(進(jìn)氣口、出氣口及采樣通道)橡皮塞的250 mL三角燒瓶組成。三角燒瓶用橡皮塞塞好后，調(diào)節(jié)氣體流量，使其在39℃條件下培養(yǎng)。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.2.2 體外發(fā)酵液

于第4期結(jié)束后次日晨飼前采集瘤胃液用于體外培養(yǎng)。在晨飼前，利用自制真空負(fù)壓裝置，通過奶牛瘤胃瘺管從3頭奶牛瘤胃內(nèi)各采取250 mL的瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾，將濾液裝于事先通有CO2的滅菌生理鹽水瓶中，混合均勻，于39℃水浴保溫。

人工唾液鹽參照Menke等[6]的方法于使用的前1天配制，按照2∶1的比例將人工唾液鹽和瘤胃液混合制備體外發(fā)酵液。

1.2.3 體外發(fā)酵底物

將粉碎的濾紙纖維素、羧甲基纖維素、果膠、木聚糖、小麥淀粉和可溶性淀粉按表2所列比例配制成精粗比分別為 40∶60、50∶50、60∶40 和 70∶30的4種半純合飼糧，作為4個時期體外培養(yǎng)的底物，底物添加量為2 g。

表2 體外培養(yǎng)底物的組成Table2 Composition of substrates used for culture in vitro %

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)本課題組前期硫胺素添加水平和體外培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果[5]，確定硫胺素的最佳添加量為180 mg/kg。試驗(yàn)采用2×4因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素1為硫胺素添加水平，設(shè)0和180 mg/kg 2個水平;因素2為底物精粗比，設(shè)4個水平，分別為 40∶60、50∶50、60∶40、70∶30。試驗(yàn)共設(shè) 8 個處理，每個處理 3個重復(fù)，于體外培養(yǎng) 0、3、6、9和12 h后采集培養(yǎng)液用于各指標(biāo)的測定。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 培養(yǎng)液中硫胺素微生物凈合成量的測定

參照董淑紅[7]的方法，采用熒光分光光度法測定未添加硫胺素時不同精粗比飼糧條件下各采樣時間點(diǎn)(0、3、6、9、12 h)培養(yǎng)液中硫胺素的含量，3、6、9、12 h 時培養(yǎng)液中硫胺素的微生物凈合成量表示為相對于0 h的增加量。

1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

培養(yǎng)液pH的測定采用雷磁pHS-3C型pH計(jì)于采樣后立即測定，培養(yǎng)液中乳酸濃度的測定參照文獻(xiàn)[8]的方法。

1.3.3 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的測定

對體外培養(yǎng)9 h的培養(yǎng)液中的細(xì)菌進(jìn)行定量。瘤胃細(xì)菌基因組DNA的提取采用反復(fù)凍融法，參照Zhou等[9]的方法進(jìn)行;瘤胃細(xì)菌定量采用PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法，引物序列見表3。PCR反應(yīng)體系(20 μL)如下:10 μmol/L 的 上、下游引物各0.8 μL，2 × SYBR Green Ⅱ 10 μL，ROX Ⅱ0.4 μL，模板 (50 ng/μL)2 μL，加無菌水至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)參照 TaKaRa試 劑 盒(DR081A，TaKaRa)說明書進(jìn)行。參照呂莉華等[10]的方法構(gòu)建質(zhì)粒，用以驗(yàn)證擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，通過SAS 9.1.3軟件中的ANOVA模塊進(jìn)行單因素及兩因素方差分析，運(yùn)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或平均值與平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 飼糧精粗比對培養(yǎng)液中硫胺素微生物凈合成量的影響

由表4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，硫胺素的微生物凈合成量呈先降低后升高的趨勢，精粗比為40∶60和50∶50的飼糧組在培養(yǎng)至6 h時其硫胺素微生物凈合成量降至最低，精粗比為60∶40和70∶30的飼糧組在培養(yǎng)至9 h時其硫胺素微生物凈合成量降至最低。隨著飼糧精料水平的增加，硫胺素的微生物凈合成量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在 3、6、12 h 時常規(guī)飼糧(精粗比為 40∶60)組和高精料飼糧(精粗比為70∶30)組差異不顯著(P＞0.05)，但上述 2組在 3、9、12 h時均顯著或極顯著低于精粗比為50∶50和60∶40的飼糧組(P＜0.05或P＜0.01)。此外，高精料飼糧(精粗比為70∶30)組硫胺素的微生物凈合成量在9 h時達(dá)到最低，極顯著低于其他各組(P＜0.01)，并且相對于其0 h時的增加量為-0.037 μg/mL。

表3 瘤胃細(xì)菌PCR的引物序列Table3 Primer sequences for PCR of rumen bacteria

表4 飼糧精粗比對培養(yǎng)液中硫胺素微生物凈合成量的影響Table4 Effects of dietary concentrate to roughage ratio on microbial net synthetic quantity of thiamine in culture solution μg/mL

2.2 飼糧精粗比和添加硫胺素對奶牛體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2.1 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液pH的影響

由表5可知，培養(yǎng)液pH與底物的精粗比有著密切的關(guān)系，除精粗比為50∶50的飼糧組與精粗比為40∶60的飼糧組在3、6、9 h時未達(dá)顯著差異(P＞0.05)外，各時間點(diǎn)培養(yǎng)液pH均隨飼糧精料水平的增加而極顯著降低(P＜0.01)，其中精粗比為70∶30的飼糧組在6、9、12 h時的培養(yǎng)液 pH均低于5.70，達(dá)到輕度亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)[12]。在體外培養(yǎng)3～12 h的時間段內(nèi)，飼糧中添加硫胺素可極顯著提高培養(yǎng)液pH(P＜0.01)。此外，各組培養(yǎng)液pH均隨著培養(yǎng)時間的延長而降低。

表5 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液pH的影響Table5 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on pH in culture solution

2.2.2 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液中乳酸濃度的影響

由表6可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，各組培養(yǎng)液中乳酸濃度均呈先上升后降低，至12 h時又有所升高的趨勢。在3 h時，精粗比為70∶30的飼糧組培養(yǎng)液中乳酸濃度極顯著高于其他3組(P＜0.01);在 6 ～12 h時，精粗比為 60∶40 和 70∶30 的飼糧組培養(yǎng)液中乳酸濃度均極顯著高于精粗比為40∶60的飼糧組(P ＜0.01)。在 3、9 h時，飼糧添加硫胺素可極顯著降低培養(yǎng)液中乳酸濃度(P＜0.01)，但在其他時間點(diǎn)飼糧添加硫胺素對培養(yǎng)液中乳酸濃度的影響差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 飼糧精粗比和添加硫胺素對奶牛體外瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 瘤胃菌群的常規(guī)PCR擴(kuò)增

以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增各目標(biāo)片段，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，牛鏈球菌、溶纖維丁酸弧菌、埃氏巨型球菌、反芻獸新月單胞菌、乳酸桿菌目標(biāo)片段常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖知，每種引物實(shí)際擴(kuò)增片段大小與預(yù)期的目的片段大小相符。將這5種PCR產(chǎn)物回收、克隆、構(gòu)建重組質(zhì)粒測定，并對陽性克隆測定，測序結(jié)果與GenBank Blast進(jìn)行序列同源性分析，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性均在95%以上，克隆的片段含有完整的引物對序列，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表6 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液中乳酸濃度的影響Table6 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on lactate concentration in culture solution mg/L

2.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

由ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀的軟件自動生成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增反應(yīng)曲線。繪制出的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:牛鏈球菌，Y=-3.05X+36.25，R2=0.996;溶纖維丁酸弧菌，Y=-3.35X+36.77，R2=0.985;埃氏巨型球菌，Y=-2.99X+42.51，R2=0.930;反芻獸新月單胞菌，Y=-2.93X+36.25，R2=0.993;乳酸桿菌，Y=-3.18X+37.45，R2=0.987。其中X表示拷貝數(shù)的對數(shù)，Y表示Ct值。5對引物的擴(kuò)增效率均在0.9～1.2的范圍內(nèi)，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合PCR定量的要求。

2.3.3 PCR定量分析飼糧精粗比和添加硫胺素對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

由表7可知，隨著底物精料水平的增加，培養(yǎng)液中牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量呈增加趨勢，而培養(yǎng)液中埃氏巨型球菌的數(shù)量則呈先升高后降低的變化趨勢。其中，精粗比為60∶40和70∶30的飼糧組培養(yǎng)液中牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量極顯著高于精粗比為40∶60和50∶50的飼糧組(P＜0.01);精粗比為50∶50和60∶40的飼糧組培養(yǎng)液中埃氏巨型球菌的數(shù)量極顯著高于精粗比為40∶60和70∶30的飼糧組(P＜0.01)。飼糧精粗比對培養(yǎng)液中溶纖維丁酸弧菌和反芻獸新月形單胞菌的數(shù)量未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。添加硫胺素可極顯著地降低培養(yǎng)液中牛鏈球菌的數(shù)量(P＜0.01)，并極顯著地提高埃氏巨型球菌的數(shù)量(P＜0.01)，但對乳酸桿菌、溶纖維丁酸弧菌和反芻獸新月單胞菌的數(shù)量未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。

圖1 瘤胃細(xì)菌16S rDNA目標(biāo)片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of target segment of rumen bacteria 16S rDNA

3 討論

3.1 飼糧精粗比對培養(yǎng)液中硫胺素微生物凈合成量的影響

硫胺素主要通過其活性物質(zhì)焦磷酸硫胺素(TPP)的形式發(fā)揮其生理功能。TPP是丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體和轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶，參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的非氧化分支[13]。在正常飼喂條件下，反芻動物瘤胃內(nèi)微生物合成的硫胺素能夠滿足動物的需要[14-15]，但在高精料飼喂條件下或特殊的生理狀態(tài)下，反芻動物有可能缺乏硫胺素[16]。Abbas等[17]研究了駱駝不同生理時期血液中硫胺素含量的變化，發(fā)現(xiàn)非泌乳期、非妊娠期的駱駝血液內(nèi)硫胺素含量顯著高于其他生理階段，泌乳期血液硫胺素含量顯著降低。硫胺素的缺乏會降低轉(zhuǎn)酮醇酶活性，增加紅細(xì)胞中TPP水平，當(dāng)TPP水平增量超過45%時就可能與硫胺素缺乏有關(guān)[18]。Karapinar等[19]通過測定奶牛血液中TPP水平以研究在高精料飼喂條件下奶牛是否缺乏硫胺素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高精料飼喂組血液中TPP水平顯著高于對照組(47.2%vs.19.53%)，這說明在高精料飼喂條件下奶牛缺乏硫胺素。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在精粗比為70∶30的高精料飼喂條件下硫胺素的微生物凈合成量顯著降低，但與精粗比為40∶60的常規(guī)飼糧相比，精粗比在50∶50和60∶40條件下硫胺素的微生物凈合成量又顯著升高，其原因可能是精粗比為40∶60的常規(guī)飼糧的能量水平相對較低，適當(dāng)?shù)奶岣呔纤娇纱龠M(jìn)瘤胃微生物合成硫胺素[20-21];但在精粗比為70∶30的高精料飼喂條件下，碳水化合物代謝所需的硫胺素增加，同時由于pH的降低導(dǎo)致瘤胃菌群結(jié)構(gòu)失衡，致使分解硫胺素的硫胺素酶合成量增加[22-24]，使得硫胺素降解量增加。此外，硫胺素的合成量與短鏈脂肪酸和丙酸的含量呈正相關(guān)[25]，而主要的丙酸產(chǎn)生菌是反芻獸新月單胞菌和埃氏巨型球菌，結(jié)合本研究中飼糧精粗比對埃氏巨型球菌數(shù)量的影響結(jié)果可知，精粗比為50∶50、60∶40的飼糧組其埃氏巨型球菌的數(shù)量顯著高于其他2組，由此推測埃氏巨型球菌數(shù)量的增加促進(jìn)了硫胺素的合成，而在精粗比為70∶30的高精料組由于培養(yǎng)液pH的改變降低了埃氏巨型球菌數(shù)量，致使硫胺素的微生物合成量下降。因此，高精料飼喂條件下，反芻動物體內(nèi)會缺乏硫胺素，而當(dāng)硫胺素缺乏時，碳水化合物代謝受阻，導(dǎo)致瘤胃乳酸積累，pH下降，最終發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒或急性瘤胃酸中毒。

3.2 飼糧精粗比和添加硫胺素對奶牛體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3.2.1 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液pH的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的指標(biāo)之一，主要受瘤胃上皮對揮發(fā)性脂肪酸吸收、食糜外流以及唾液分泌量的影響。由于本試驗(yàn)采用的是體外批次培養(yǎng)法，沒有瘤胃對揮發(fā)性脂肪酸的吸收和底物的外流，人工唾液鹽的緩沖能力也會隨時間的延長而降低，導(dǎo)致飼糧中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)物大量積累，使得各組培養(yǎng)液pH整體上呈不斷下降趨勢，但在3 h時，精粗比為40∶60 和50∶50 飼糧組的pH有所升高，原因可能是體外精料水平的降低使得瘤胃發(fā)酵速度減慢。在本試驗(yàn)中，高精料飼糧(精粗比為70∶30)組在3～12 h時間內(nèi)培養(yǎng)液的pH均顯著低于常規(guī)飼糧(精粗比為40∶60)組，究其原因可能是由于高精料飼糧組培養(yǎng)底物中有較高的可溶性碳水化合物，其在瘤胃中發(fā)酵速度較快，從而使微生物產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和其他有機(jī)酸的速度加快，而pH的降低又進(jìn)一步促使酸利用菌與酸產(chǎn)生菌間的數(shù)量失衡，致使pH進(jìn)一步降低。

表7 飼糧精粗比和添加硫胺素對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響Table7 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on structure of rumen microbial community lg(拷貝數(shù)/μL)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，向各飼糧中添加硫胺素均能有效地提高培養(yǎng)液的pH，這與大多數(shù)的研究結(jié)果一致[3，26]。結(jié)合本試驗(yàn)其他指標(biāo)測定結(jié)果分析，pH的升高可能是由于硫胺素促進(jìn)了埃氏巨型球菌和反芻獸新月單胞菌的生長，從而促進(jìn)乳酸的分解，同時硫胺素抑制了牛鏈球菌的增殖而減少了乳酸的生成量，致使乳酸濃度降低。

3.2.2 飼糧精粗比和添加硫胺素對培養(yǎng)液乳酸濃度的影響

乳酸是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物，由丙酮酸還原而成，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乳酸被乳酸利用菌轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸，為反芻動物提供能量。但長時間飼喂反芻動物高精料飼糧時，瘤胃的消化功能會發(fā)生紊亂，乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌的平衡被打破，瘤胃內(nèi)積蓄的乳酸就會異常升高，將會導(dǎo)致瘤胃酸中毒[27]。因此，降低乳酸的濃度對于維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和防止瘤胃酸中毒非常重要。張紅偉等[3]以高精料為發(fā)酵底物，體外培養(yǎng)12 h后發(fā)現(xiàn)添加硫胺素60、90 mg/kg的試驗(yàn)組的乳酸濃度較對照組分別下降42.2%、33.7%。本試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，隨著精料水平的提高，培養(yǎng)液中乳酸濃度上升，添加硫胺素可顯著降低培養(yǎng)液乳酸濃度，其可能原因是精料中易發(fā)酵碳水化合物含量較高，瘤胃中硫胺素的微生物合成量難以滿足碳水化合物代謝的需要，導(dǎo)致碳水化合物代謝受阻，乳酸濃度升高;另外，因飼糧中添加硫胺素可提高瘤胃pH以緩解瘤胃的酸性環(huán)境，并逐漸恢復(fù)乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌的平衡，使得硫胺素的增加量要大于硫胺素的減少量，從而滿足了能量代謝的需要，使碳水化合物的降解順利進(jìn)行，減少乳酸的積累[4]。

3.3 飼糧精粗比和添加硫胺素對奶牛體外瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乳酸菌主要包括牛鏈球菌、淀粉分解菌(溶纖維丁酸弧菌)和乳酸桿菌。牛鏈球菌具有很強(qiáng)的利用淀粉產(chǎn)生乳酸的能力[28]。通常，當(dāng)突然飼喂動物含高淀粉的精料飼料時易發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒和pH的降低，致使牛鏈球菌大量快速增殖[29]，當(dāng) pH低于5.75時，該菌體內(nèi)1，6-二磷酸激酶(FDP)、磷酸丙糖和丙酮酸濃度增加，乳酸脫氫酶(LDH)被激活，促使代謝終產(chǎn)物乳酸大量積累[30]。本研究結(jié)果表明，隨著精料水平的提高，牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量逐漸提高，在不添加硫胺素的情況下，70%精料水平組與40%精料水平組相比分別提高了6.31%和5.29%，這與其他研究結(jié)果相似[31-33]，但對溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量無顯著性影響，這與趙培廳等[34]的結(jié)果相反，原因可能是溶纖維丁酸弧菌是一種嚴(yán)格厭氧型革蘭氏陽性菌，而本試驗(yàn)采用體外批次培養(yǎng)法，其生長活性受到抑制。同時，添加硫胺素可極顯著降低牛鏈球菌的數(shù)量，但對乳酸桿菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量無顯著影響，該結(jié)果與王洪榮等[4]的研究結(jié)果一致，說明硫胺素在一定程度上能夠抑制牛鏈球菌的增殖。結(jié)合本試驗(yàn)中硫胺素對乳酸濃度和pH影響的試驗(yàn)結(jié)果，出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是硫胺素的添加促進(jìn)了碳水化合物的代謝，減少了丙酮酸的積累，使得乳酸脫氫酶活性降低，從而降低了乳酸的濃度，進(jìn)而使pH有所升高，從而導(dǎo)致牛鏈球菌的數(shù)量降低;牛鏈球菌生長被抑制將進(jìn)一步降低乳酸的產(chǎn)生量，從而改善瘤胃發(fā)酵，使瘤胃菌群結(jié)構(gòu)逐漸趨于平衡。

反芻獸新月單胞菌和埃氏巨型球菌是瘤胃內(nèi)主要的乳酸利用菌。其中，反芻獸新月單胞菌可以利用累積的乳酸形成乙酸和丙酸，它還有脫羧基作用，能使琥珀酸脫羧基形成丙酸[24]，但反芻獸新月形單胞菌發(fā)酵乳酸的能力因可溶性糖的增加受到抑制[35]。埃氏巨型球菌可通過乳酸-丙烯酸和琥珀酸2條途徑將乳酸分解為丙酸[36]，但在高精料飼糧情況下，乳酸-丙烯酸途徑是其生成丙酸的主要途徑。在高精料飼糧條件下，埃氏巨型球菌可以代謝掉70%的乳酸[37]，在飼喂高精料飼糧的綿羊瘤胃中，埃氏巨型球菌占乳酸利用菌總數(shù)的21%[38]。本研究表明，在逐漸提高飼糧精料水平的過程中，埃氏巨型球菌的數(shù)量急劇增加，但是當(dāng)精料水平達(dá)到70%時，該菌的數(shù)量又急劇降低，而反芻獸新月單胞菌的數(shù)量在4種飼糧條件下差異不顯著，原因可能是飼糧營養(yǎng)水平的適量提高促進(jìn)了埃氏巨型球菌的增殖，但精料水平達(dá)到70%時，由于大量碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸，pH顯著降低，超過了埃氏巨型球菌耐受酸度的閾值，造成其數(shù)量急劇下降。而反芻獸新月單胞菌的數(shù)量變化差異不顯著，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)所用底物為半純合飼糧，含有大量的碳水化合物，抑制了該菌的繁殖。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，添加硫胺素能極顯著地提高埃氏巨型球菌的數(shù)量，說明硫胺素可通過促進(jìn)乳酸利用菌的生長而改善瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的平衡。

4 結(jié)論

①在高精料飼糧條件下，瘤胃內(nèi)硫胺素微生物凈合成量降低，發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒。

②添加的硫胺素可通過改善瘤胃發(fā)酵，調(diào)節(jié)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)來緩解亞急性瘤胃酸中毒。

[1]陳淵，朱家增，鄧立新，等.牛瘤胃酸中毒發(fā)病機(jī)制與防治的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(6):132-135.

[2]YANG Y，LIU D C，LU D X，et al.Effects of adding both disodium fumarate and monensin on rumen fermentation and bacterial number amounts in dairy goats suffered from subacute rumen acidosis[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2009，21(2):258-262.

[3]張紅偉，王洪榮，劉翔，等.高精料日糧條件下維生素B1對山羊瘤胃體外發(fā)酵的影響[J].中國奶牛，2010(3):13-16.

[4]王洪榮，張紅偉.硫胺素和硫水平對山羊人工瘤胃代謝和微生物菌群的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(8):1595-1605.

[5]郝志敏，王洪榮，潘曉花，等.高精料日糧下硫胺素對體外培養(yǎng)荷斯坦牛瘤胃微生物消化代謝的影響[J].中國奶牛，2011(18):8-12.

[6]MENKE K H，STEINGASS H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis andin vitro gas production using rumen fluid[J].Animal Research and Development，1988，28:7-55.

[7]董淑紅.硫胺素對山羊瘤胃代謝的影響及其與亞急性瘤胃酸中毒關(guān)系的研究[D].碩士學(xué)位論文.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2011:37-38.

[8]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社，1997:422-428.

[9]ZHOU J，BRUNS M A，TIEDJE J M.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62(2):316-322.

[10]呂莉華，侯先志，王海榮，等.定量檢測瘤胃纖維降解細(xì)菌的 RT-PCR法[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(6):1795-1803.

[11]OUWERKERK D，KLIEVE A V，F(xiàn)ORSTER R J.E-numeration of Megasphaera elsdenii in rumen contents by real-time Taq nuclease assay[J].Journal of Applied Microbiology，2002，92:753-758.

[12]PENNER G B，BEAUCHEMIN K A，MUTSVANGWA T.Severity of ruminal acidosis in primiparous Holstein cows during the periparturient period[J].Journal of Dairy Science，2007，90:365-375.

[13]BRENT B E，BARTLEY E E.Thiamine and niacin in the rumen[J].Journal of Animal Science，1984，59:813-822.

[14]ZINN R A，OWEN F N，STUART R L，et al.B-vitamin supplementation of diets for feedlot calves[J].Journal of Animal Science，1987，65:267-277.

[15]SANTSCHI D E，BERTHIAUME R，MATTE J J，et al.Fate of supplementary B-vitamins in the gastrointestinal tract of dairy cows[J].Journal of Dairy Science，2005，88:2043-2054.

[16]KARAPINAR T，DABAK M，KIZIL O，et al.Severe thiamine deficiency in sheep with acute ruminal lactic acidosis[J].Journal of Veterinary Internal Medicine，2008，22:662-665.

[17]ABBAS T A，ALHAJALI M，ABU DAMIR H.Thiamine(vitamin B1)status in the blood of young，pregnant，lactating and racing dromedary camels(Camelus Dromedarius)in UAE[J].Revue de Médecine Vétérinaire，2008，159(11):545-550.

[18]REHM W F，ZEROBIN K，CHRISTELLER S，et al.Diagnosis of clinical vitamin B1deficiency in cattle[J].Berl Münch Tiearar Wochenschr，1971，84:64-67.

[19]KARAPINAR T，DABAK M，KIZIL O.Thiamine status of feedlot cattle fed a high-concentrate diet[J].The Canadian Veterinary Journal，2010，51(11):1251-1253.

[20]FRASER C M.Polioencephalomalacia[M]//FRASER M C.The merck veterinary manual.7th ed.Rathway:Merck Sharp and Dohme Inc.，1991:614-616.

[21]GEORGE L W.Diseases of the nervous system:polioencephalomalacia[M]//SMITH B P.Large animal internal medicine.2nd ed.St Louise MS:Mosby，1996:1055-1062.

[22]BRENT B E.Relationship of acidosis to other feedlot ailments[J].Journal of Animal Science，1976，43:930-935.

[23]NOCEK J E.Bovine acidosis:implications on laminitis[J].Journal of Dairy Science，1997，80:1005-1028.

[24]PIERSON R E，JENSEN R.Polioencephalomalacia in feedlot lambs[J].Journal of the American Veterinary Medical Association，1975，166:257-259.

[25]TAFAJ M，SCHOLLENBERGER M，F(xiàn)EOFILOWA J，et al.Relationship between thiamine concentration and fermentation patterns in the rumen fluid of dairy cows fed with graded concentrate levels[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2006，90(7/8):335-343.

[26]董淑紅，王洪榮，王劍飛，等.高精日糧條件下硫胺素對山羊瘤胃代謝的影響[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010(6):6-7.

[27]胡紅蓮.奶山羊亞急性瘤胃酸中毒營養(yǎng)生理機(jī)制的研究[D].博士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008:2-4.

[28]TAJIMA K，AMINOV R I，NAGAMINE T，et al.Diet-dependent shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCR[J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67:2766-2774.

[29]KHAFIPOUR E，LI S C，PLAIZIER J C，et al.Rumen microbiome composition determined using two nutritional models of subacute ruminal acidosis[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology，2009，75(20):7115-7124.

[30]RUSSELL J B，HINO T.Regulation of lactate production in Streptococcus bovis:a spiraling effect that contributes to rumen acidosis[J].Journal of Dairy Science，1985，68(7):1712-1721.

[31]魏德泳，朱偉云，毛勝勇.日糧不同NFC/NDF比對山羊瘤胃發(fā)酵與瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(7):1392-1398.

[32]劉燁彤，劉大程，盧德勛，等.慢性瘤胃酸中毒狀態(tài)下奶山羊瘤胃細(xì)菌內(nèi)幾種相關(guān)細(xì)菌數(shù)量變化的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(3):123-126.

[33]韓昊奇，劉大程，高 民，等.不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃微生物及瘤胃pH變化的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(4):597-603.

[34]趙培廳，劉大程，高民，等.飼糧不同NFC/NDF對奶山羊瘤胃溶纖維丁酸弧菌、牛鏈球菌及埃氏巨型球菌含量變化的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(10):1716-1724.

[35]馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2004:36.

[36]COUOTTE G M，PRINS R A，JANSSEN R M，et al.Role of Megasphaera elsdenii in the fermentation of DL-lactate in the rumen of dairy cattle[J].Applied and Environmental Microbiology，1981，42:649-655.

[37]COUNOTTE G H M，LANKHORST A，PRINS R A.Role of DL-lactic acid as an intermediate in rumen metabolism of dairy cows[J].Journal of Animal Science，1983，56:1222-1235.

[38]MACKIE R I，AMINOV R I，WHITE B A，et al.Molecular ecology and diversity in gut microbial ecosysems[M]//CRONJE P B.Ruminant physiology:digestion，metabolism，growth and reproduction.London:CAB International，2000:61-77.