季 昀 龐學(xué)燕 田 青 王夢芝 王洪榮* 敖長金

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

生長激素(growth hormone，GH)是一種由動物垂體前葉合成分泌的肽類激素。在動物體內(nèi)，GH通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育，促進(jìn)脂肪分解、蛋白質(zhì)合成以及肝臟糖異生作用，還具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫等多種生理學(xué)功能。早期的大量研究證實(shí)了GH具有明顯的促乳作用，能夠提高奶牛泌乳量、乳成分產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化效率[1-6]。這一方面得益于GH在體內(nèi)的營養(yǎng)分配功能[7-8]，促使更多的營養(yǎng)物質(zhì)分配到乳腺;另一方面歸因于其促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育，提高腺泡活性，維持泌乳持久性的作用[9]。GH能夠刺激肝臟合成分泌大量的胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor-I，IGF-Ⅰ)[10-11]，而研究發(fā)現(xiàn)奶牛血液IGF-Ⅰ含量通常與泌乳量呈正相關(guān)[12]，另外，前人證實(shí)了奶牛乳腺組織上存在生長激素受體(GHR)[13]和胰島素樣生長因子Ⅰ受體(IGF-ⅠR)[14]，因此 GH可能是直接作用于乳腺上的GHR或通過刺激IGF-Ⅰ的合成間接作用于乳腺來發(fā)揮作用的[15]，深入研究GH和IGF-Ⅰ對奶牛乳腺的作用機(jī)理對奶業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。GH能夠提高奶牛乳蛋白和酪蛋白產(chǎn)量[7，16]，而這種產(chǎn)量的提高可能也與血液中IGF-Ⅰ濃度的升高有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)陰外動脈灌注IGF-Ⅰ能明顯促進(jìn)乳汁分泌，提高乳腺血流量[17-18]。在組織細(xì)胞水平上，利用奶牛乳腺組織或乳腺上皮細(xì)胞為模型的相關(guān)研究已報(bào)道了GH能夠促進(jìn)αs-酪蛋白的合成[19]和 β - 酪蛋白基因的表達(dá)[20]，IGF-Ⅰ能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成[21]，但它們調(diào)控乳蛋白合成的機(jī)理還未完全闡明，前人的研究表明乳蛋白合成在轉(zhuǎn)錄水平受到Janus激酶2-轉(zhuǎn)錄激活子5(JAK2-STAT5)信號通路調(diào)節(jié)[22]，在翻譯水平主要受到mTOR信號通路調(diào)控[23]，而 GH和IGF-Ⅰ對這些信號通路上與調(diào)控乳蛋白合成有關(guān)的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)量是否有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道較少見，因此本試驗(yàn)以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究材料，首先用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)法在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中檢測是否有GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)，確定胞外GH和IGF-Ⅰ是否直接作用于受體來發(fā)揮作用;然后測定 GH和 IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表達(dá)量的影響;最后在前人的研究基礎(chǔ)上，選擇在胞內(nèi)與乳蛋白合成調(diào)控相關(guān)的一些重要的激酶和調(diào)節(jié)因子，探究GH和IGF-Ⅰ對這些基因mRNA表達(dá)量的影響，旨在為GH和IGF-Ⅰ調(diào)控乳蛋白合成的機(jī)理奠定一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器

電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(CKX41，Olympus)、超低溫冰箱(美國 Thermo)、冷凍離心機(jī)(5415R型，德國Eppendorf)、常溫低速離心機(jī)(上海盧湘儀)、PCR儀(ABI 2720型)、NanoDrop ND-1000濃度測定儀(美國Thermo)、RT-qPCR儀(ABI 7500型)、普通PCR儀(ABI 2720型)、凝膠成像系統(tǒng)(Infinity 3026型，法國Vilber)等。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco)、胎牛血清(美國Gibco)、碳酸氫鈉(美國Sigma)、青鏈霉素(美國Gibco)、兩性霉素B(美國Amresco)、表皮生長因子(美國Gibco)、催乳素(美國Sigma)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(美國Gibco)、皮質(zhì)醇(美國Sigma)、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國 Thermo)、重組牛 GH(美國RayBiotech)、重 組 IGF-Ⅰ (美 國 Peprotech)、RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScripRT Master Mix(日本 TaKa-Ra)、SYBPremix Ex TaqTMⅡ(日本 TaKaRa)、Takara TaqTM試劑盒(日本TaKaRa)等。

1.1.3 細(xì)胞來源

乳腺組織來自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場提供的泌乳中后期健康中國荷斯坦奶牛，運(yùn)用手術(shù)法活體采集5 g左右乳腺組織進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)采用膠原酶消化法進(jìn)行，傳代及純化過程中用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)除去成纖維細(xì)胞。得到的純?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞用凍存液于-70℃凍存待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，加入生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清，并補(bǔ)充100 U/mL青鏈霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、1 μg/mL催乳素、1 μg/mL 胰島素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白 -硒、500 ng/mL氫化可的松以及10 ng/mL表皮生長因子)，按照5×104個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，每孔2 mL。24 h細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌各孔2次，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞16 h，再用PBS洗滌各孔2次，然后按照如下方案對細(xì)胞處理24 h:對照組采用無血清生長培養(yǎng)基;GH組采用無血清生長培養(yǎng)基+GH(100 ng/mL);IGF-Ⅰ組采用無血清生長培養(yǎng)基+IGF-Ⅰ(100 ng/mL);GH+IGF-Ⅰ組采用無血清生長培養(yǎng)基 +GH(100 ng/mL)+IGF-Ⅰ(100 ng/mL)]，每孔加2 mL培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每孔為1個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞總RNA的提取

細(xì)胞處理完成后，總RNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。用NanoDrop ND-1000核酸蛋白測定儀測定提取的總RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳測定其完整性?？俁NA于-70℃保存，待反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

1.3.3 PCR檢測GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)

PCR反應(yīng)使用Takara TaqTM試劑盒于普通PCR儀上進(jìn)行。按照試劑盒說明配制反應(yīng)液:TaKaRa Taq(5 U/μL)0.25 μL、10 × PCR 緩沖液(含 Mg2+)5 μL、dNTP 4 μL、模板 cDNA 250 ng、上游和下游引物(20 μmol/L)各 1 μL;加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5 min;94℃50 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR反應(yīng)中引物序列見表1。GHR引物參照文獻(xiàn)[24]，IGF-ⅠR引物采用 Primer 3引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察結(jié)果。

表1 GHR和IGF-ⅠR基因引物序列Table1 Sequences of primers for GHR and IGF-ⅠR genes

1.3.4 RT-qPCR法測定mRNA表達(dá)量

通過熔解曲線和1%瓊脂糖凝膠電泳判定PCR反應(yīng)的特異性。

以GAPDH為內(nèi)參基因計(jì)算各基因的mRNA表達(dá)量，計(jì)算公式[26]為:

式中:E目的基因和 E內(nèi)參基因分別為該基因的 PCR擴(kuò)增效率;Ct為閾值循環(huán)。PCR擴(kuò)增效率通過LinReg PCR 11.0 軟件計(jì)算[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SAS 9.1軟件ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)蘇后奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁與增殖情況

復(fù)蘇后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h大部分已貼壁(圖1)，細(xì)胞成活率達(dá)90%以上，并保持了較高的增殖活性，凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 總RNA提取

從奶牛乳腺上皮細(xì)胞中提取的總RNA經(jīng)測定，各樣本 OD260nm/OD280nm均介于1.9～2.1之間，表明總RNA純度較高。另外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明總RNA完整性較好?？傊俁NA樣本質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

2.3 GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳觀察到與目的片段大小相吻合的條帶(圖2)，且無雜帶產(chǎn)生，表明該試驗(yàn)中體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠表達(dá) GHR和 IGF-ⅠR mRNA，GH和 IGF-Ⅰ通過作用于乳腺上皮細(xì)胞上的相應(yīng)的受體來發(fā)揮各自的作用。

2.4 GH和IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量的影響

由圖3可見，在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上單獨(dú)添加100 ng/mL的GH或IGF-Ⅰ均能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，二者聯(lián)合添加也能顯著促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，但與2個(gè)單獨(dú)添加組差異不顯著(P＞0.05)。

RT-qPCR熔解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果表明無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，且擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的基因的片段大小相符合，表明較準(zhǔn)確地對κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)進(jìn)行了相對定量。

表2 RT-qPCR各基因引物序列Table2 Sequences of primers for the RT-qPCR

圖1 復(fù)蘇后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁和生長狀況Fig.1 Status of adherence and growth of bovine mammary epithelial cells after resuscitated

2.5 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)量的影響

由表3可見，在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充 GH、IGF-Ⅰ或 GH+IGF-Ⅰ，處理 24 h 后對 JAK2、STAT5、4EBP1、真核生物起始因子4E(eIF4E)、真核生物延伸因子2(eEF2)mRNA的表達(dá)量沒有顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比，GH組ELF5 mRNA表達(dá)量有提高的趨勢(P＜0.10)。IGF-Ⅰ組哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖體蛋白S6激酶1(rpS6K1)mRNA的表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)。盡管GH+IGF-Ⅰ組rpS6K1 mRNA表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)，但其表達(dá)量與IGF-Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05)。

各基因RT-qPCR反應(yīng)熔解曲線均為單一峰，無任何雜峰出現(xiàn)，此外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各基因擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，且符合擴(kuò)增產(chǎn)物大小，表明RT-qPCR過程中無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，較準(zhǔn)確地定量了各基因mRNA的表達(dá)量。

圖2 GHR和IGF-ⅠR基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram for PCR products of GHR and IGF-ⅠR genes

圖3 κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量Fig.3 The mRNA expression level of CSN3

3 討論

3.1 GH和IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量的影響

乳蛋白主要由酪蛋白(αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白)和清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)組成，為了解釋GH和IGF-Ⅰ促進(jìn)乳蛋白合成的機(jī)理，許多國外學(xué)者做了相關(guān)的研究，Yang等[20]和Sakamoto等[19]于同年分別發(fā)現(xiàn)了GH對奶牛乳腺組織β-酪蛋白基因表達(dá)的促進(jìn)作用和GH提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞αs1-酪蛋白基因表達(dá)、蛋白合成的作用，同時(shí)用免疫組化法檢測到了GHR基因的表達(dá)，近年來，Johnson等[28]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)GH可提高αs1-酪蛋白基因表達(dá)量，此外還發(fā)現(xiàn)GH可促進(jìn)α-乳白蛋白基因的表達(dá)，同時(shí)在MAC-T細(xì)胞上檢測到了GHR基因的表達(dá)。原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞多次經(jīng)過傳代后，αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白基因表達(dá)量均有所下降，但κ-酪蛋白基因表達(dá)量比其他酪蛋白更穩(wěn)定，此外，κ-酪蛋白是4種酪蛋白中的一種極其重要的種類，它不但能促進(jìn)酪蛋白膠束的形成，還影響乳的許多物理特性[29]，κ-酪蛋白的糖基化程度可影響泌乳量、蛋白和酪蛋白含量[30]，κ-酪蛋白基因敲除的小鼠乳酪蛋白膠束不穩(wěn)定且不能泌乳[31]。鑒于κ-酪蛋白的重要性及其基因表達(dá)的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)選擇了κ-酪蛋白為研究對象，發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進(jìn)κ-酪蛋白基因的表達(dá)，這與Zhou等[24]的研究結(jié)果不一致，他們發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進(jìn)αs1-、αs2-、β-酪蛋白以及α-乳白蛋白基因的表達(dá)，κ-酪蛋白基因的表達(dá)有所提高但差異不顯著，原因可能與細(xì)胞來源和處理方式的不同有關(guān)，Zhou等[24]利用的是轉(zhuǎn)染了GHR和STAT5基因的MAC-T細(xì)胞且處理方式為單一添加GH，而本試驗(yàn)則是用從奶牛乳腺組織中分離培養(yǎng)并傳代純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，處理方式是在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加GH。關(guān)于IGF-Ⅰ對酪蛋白基因表達(dá)量的研究尚未見報(bào)道，Burgos等[21]近年來報(bào)道了 IGF-Ⅰ能顯著促進(jìn)MAC-T細(xì)胞總蛋白的合成，而本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量。與對照組相比，GH和IGF-Ⅰ同時(shí)添加到無血清生長培養(yǎng)基中顯著促進(jìn)了κ-酪蛋白mRNA表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)協(xié)同或累積效應(yīng)，聯(lián)合添加GH與IGF-Ⅰ與單獨(dú)添加GH或IGF-Ⅰ促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)的效果差異不顯著。另外，本試驗(yàn)檢測到了GHR和IGF-ⅠR mRNA在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，表明GH和IGF-Ⅰ通過與細(xì)胞受體結(jié)合激活胞內(nèi)信號通路，進(jìn)而促進(jìn)酪蛋白的表達(dá)。

表3 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)量的影響Table3 Effects of GH and IGF-Ⅰon mRNA expression levels of key kinases and factors regulating milk protein synthesis

3.2 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄可受到JAK2-STAT5信號通路的調(diào)節(jié)，而JAK2-STAT5信號通路可能是多種激素的共同作用路徑。當(dāng)胞內(nèi)激素受體與激素結(jié)合后發(fā)生二聚，引起交叉磷酸化，使得JAK2被激活并發(fā)生酪氨酸磷酸化，為STAT5提供停留位點(diǎn)，進(jìn)而使STAT5在JAK2的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化的STAT5發(fā)生二聚移向細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA結(jié)合，激活乳蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄[32-33]。另外，該信號通路對于乳腺發(fā)育、乳腺上皮細(xì)胞的增殖與分化也發(fā)揮重要作用，無JAK2的小鼠在分娩時(shí)不但不能形成分泌腺泡而且激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖嚴(yán)重減少[34]。反芻動物與嚙齒類動物不同，乳蛋白基因的高表達(dá)并非主要通過催乳素調(diào)控STAT5活性來實(shí)現(xiàn)，GH和IGF-Ⅰ可能也發(fā)揮了很大的作用[35]。一方面，GH和IGF-Ⅰ也可以調(diào)控STAT5-DNA結(jié)合活性。高濃度或生理范圍的催乳素、GH或IGF-Ⅰ均能提高體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織的STAT5-DNA結(jié)合活性，同時(shí)添加GH和催乳素的奶牛乳腺組織的STAT5活性顯著高于單一添加其中一種激素[36]。另一方面，GH和IGF-Ⅰ可能對STAT5的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響。Boutinaud等[37]給奶山羊每日外源補(bǔ)充GH，23 d后發(fā)現(xiàn)GH顯著提高了乳腺STAT5蛋白合成量和基因表達(dá)量，而本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加GH和IGF-Ⅰ在24 h內(nèi)不影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2和STAT5 mRNA的表達(dá)。Yang等[36]也發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在短時(shí)間內(nèi)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織STAT5蛋白豐度沒有影響，因此GH和IGF-Ⅰ對STAT5基因表達(dá)和STAT5蛋白合成產(chǎn)生明顯作用可能需要較長的作用時(shí)間，而短時(shí)間內(nèi)它們可促進(jìn)STAT5-DNA結(jié)合活性。ELF5屬于ETS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，它不但能夠調(diào)控乳腺細(xì)胞JAK2-STAT5信號通路，明顯促進(jìn)STAT5活性，而且它自身的基因表達(dá)也受到STAT5的調(diào)控[38-39]。缺少ELF5基因的小鼠乳腺STAT5的基因表達(dá)量和蛋白活性降低[40]，進(jìn)而引起小鼠乳蛋白合成的下降[41]，這可能是因?yàn)镋LF5可通過抑制細(xì)胞因子信號抑制物(SOCS)基因表達(dá)來提高STAT5的活性[40]。雖然在奶牛乳腺組織上也發(fā)現(xiàn)了ELF5對乳蛋白合成起重要作用[24]，但關(guān)于GH和IGF-Ⅰ對ELF5基因表達(dá)量的影響到目前尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)盡管GH在24 h內(nèi)沒有顯著促進(jìn)ELF5 mRNA的表達(dá)，但有提高其表達(dá)量的趨勢，沒有進(jìn)一步影響到STAT5 mRNA的表達(dá)。

3.3 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白翻譯的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

mTOR信號通路在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成上的作用已被廣泛證實(shí)，其下游靶標(biāo)rpS6K1、4EBP1、eEF2等在蛋白質(zhì)翻譯起始或延伸過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。mTOR通過提高rpS6K1的活性促使核糖體蛋白S6發(fā)生磷酸化進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯起始和延伸的進(jìn)行[42-43];通過促進(jìn) 4EBP1磷酸化使eIF4E得以解離并與真核生物起始因子4G(eIF4G)、真核生物起始因子4A(eIF4A)等起始因子等形成eIF4F起始復(fù)合物，啟動含帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始[44];eEF2受到 eEF2激酶的調(diào)節(jié)，rpS6K1可使其下游的eEF2激酶發(fā)生磷酸化以抑制eEF2激酶活性，這有利于eEF2發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而使翻譯延伸能夠順利進(jìn)行[42]。前人在奶牛乳腺上的研究已發(fā)現(xiàn)了rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 等對乳蛋白合成有重要作用[23，45-47]?；谶@些研究的基礎(chǔ)之上，本試驗(yàn)選擇了在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E 和 eEF2，觀察它們的 mRNA表達(dá)量是否受到GH和IGF-Ⅰ的影響。研究結(jié)果表明在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充GH沒有顯著影響mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 mRNA 的表達(dá)量，這與Hayashi等[16]的奶牛體內(nèi)研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)給奶牛皮下注射GH顯著提高了乳蛋白產(chǎn)量及奶牛乳腺 eIF4E和 eEF2的蛋白豐度，但eIF4E、mTOR和 eEF2 mRNA表達(dá)量未受影響。GH可能在調(diào)控mTOR下游靶標(biāo)磷酸化水平上有重要作用，因?yàn)樵诟伟┘?xì)胞上的研究證明了mTOR信號通路在GH對蛋白質(zhì)合成的快速激活中發(fā)揮重要作用，且能促進(jìn)mTOR下游靶標(biāo)的磷酸化[48]，但在乳腺上皮細(xì)胞上是否存在同樣的作用需要進(jìn)一步的研究。Burgos等[21]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞為研究模型，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ在顯著提高蛋白質(zhì)合成同時(shí)顯著提高了S6K1、4EBP1磷酸化水平以及eIF4G與eIF4E的結(jié)合量，并顯著降低4EBP1與eIF4E的結(jié)合量，而IGF-Ⅰ是否影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2基因的表達(dá)量尚未見報(bào)道，在本試驗(yàn)條件下IGF-Ⅰ顯著促進(jìn)了mTOR和rpS6K1 mRNA的表達(dá)量，其他基因未受到影響。研究發(fā)現(xiàn)GH可通過抑制胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)基因的表達(dá)，降低 IGFBP-5對 IGF-Ⅰ的高親和力來促進(jìn)IGF-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用[49]，表明GH和IGF-Ⅰ存在一定的協(xié)同作用，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合添加GH和IGF-Ⅰ雖能顯著提高rpS6K1 mRNA的表達(dá)量，但與單獨(dú)添加IGF-Ⅰ產(chǎn)生的作用差異不顯著，另外GH+IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)量也未發(fā)現(xiàn)累積效應(yīng)，因此GH和IGF-Ⅰ對乳腺上皮細(xì)胞的協(xié)同作用可能表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡方面，這尚需進(jìn)一步的研究。綜合前人和本試驗(yàn)的研究結(jié)果，GH和IGF-Ⅰ可能在基因表達(dá)、蛋白豐度以及磷酸化水平多個(gè)層次下調(diào)控參與調(diào)節(jié)乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的合成，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)理仍需進(jìn)一步通過大量的體內(nèi)外試驗(yàn)研究來確證。

4 結(jié)論

①在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充GH和IGF-Ⅰ能夠顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量，這是GH和IGF-Ⅰ通過分別作用于其受體來激活胞內(nèi)信號通路實(shí)現(xiàn)的，但未發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量方面存在聯(lián)合效應(yīng)。

②在本試驗(yàn)條件下，單獨(dú)補(bǔ)充GH有促進(jìn)ELF5 mRNA表達(dá)量的趨勢;單獨(dú)添加IGF-Ⅰ可顯著提高mTOR和rpS6K1 mRNA表達(dá)量，但GH沒有進(jìn)一步加強(qiáng)IGF-Ⅰ的這種作用，表明 GH和IGF-Ⅰ可單獨(dú)通過影響調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶及調(diào)節(jié)因子基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)κ-酪蛋白的合成。

致謝:

感謝揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院李建基教授、王亨副教授在奶牛乳腺手術(shù)活體采樣上給予的大力幫助;感謝徐柏林碩士在奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)上給予的耐心指導(dǎo)。

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