季 昀 龐學燕 田 青 王夢芝 王洪榮* 敖長金

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，揚州 225009;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

生長激素(growth hormone，GH)是一種由動物垂體前葉合成分泌的肽類激素。在動物體內(nèi)，GH通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育，促進脂肪分解、蛋白質(zhì)合成以及肝臟糖異生作用，還具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫等多種生理學功能。早期的大量研究證實了GH具有明顯的促乳作用，能夠提高奶牛泌乳量、乳成分產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化效率[1-6]。這一方面得益于GH在體內(nèi)的營養(yǎng)分配功能[7-8]，促使更多的營養(yǎng)物質(zhì)分配到乳腺;另一方面歸因于其促進乳腺腺泡發(fā)育，提高腺泡活性，維持泌乳持久性的作用[9]。GH能夠刺激肝臟合成分泌大量的胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor-I，IGF-Ⅰ)[10-11]，而研究發(fā)現(xiàn)奶牛血液IGF-Ⅰ含量通常與泌乳量呈正相關(guān)[12]，另外，前人證實了奶牛乳腺組織上存在生長激素受體(GHR)[13]和胰島素樣生長因子Ⅰ受體(IGF-ⅠR)[14]，因此 GH可能是直接作用于乳腺上的GHR或通過刺激IGF-Ⅰ的合成間接作用于乳腺來發(fā)揮作用的[15]，深入研究GH和IGF-Ⅰ對奶牛乳腺的作用機理對奶業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。GH能夠提高奶牛乳蛋白和酪蛋白產(chǎn)量[7，16]，而這種產(chǎn)量的提高可能也與血液中IGF-Ⅰ濃度的升高有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)陰外動脈灌注IGF-Ⅰ能明顯促進乳汁分泌，提高乳腺血流量[17-18]。在組織細胞水平上，利用奶牛乳腺組織或乳腺上皮細胞為模型的相關(guān)研究已報道了GH能夠促進αs-酪蛋白的合成[19]和 β - 酪蛋白基因的表達[20]，IGF-Ⅰ能促進奶牛乳腺上皮細胞蛋白質(zhì)的合成[21]，但它們調(diào)控乳蛋白合成的機理還未完全闡明，前人的研究表明乳蛋白合成在轉(zhuǎn)錄水平受到Janus激酶2-轉(zhuǎn)錄激活子5(JAK2-STAT5)信號通路調(diào)節(jié)[22]，在翻譯水平主要受到mTOR信號通路調(diào)控[23]，而 GH和IGF-Ⅰ對這些信號通路上與調(diào)控乳蛋白合成有關(guān)的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的mRNA表達量是否有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報道較少見，因此本試驗以奶牛乳腺上皮細胞為研究材料，首先用實時定量PCR(RT-qPCR)法在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中檢測是否有GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達，確定胞外GH和IGF-Ⅰ是否直接作用于受體來發(fā)揮作用;然后測定 GH和 IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表達量的影響;最后在前人的研究基礎(chǔ)上，選擇在胞內(nèi)與乳蛋白合成調(diào)控相關(guān)的一些重要的激酶和調(diào)節(jié)因子，探究GH和IGF-Ⅰ對這些基因mRNA表達量的影響，旨在為GH和IGF-Ⅰ調(diào)控乳蛋白合成的機理奠定一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器

電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(CKX41，Olympus)、超低溫冰箱(美國 Thermo)、冷凍離心機(5415R型，德國Eppendorf)、常溫低速離心機(上海盧湘儀)、PCR儀(ABI 2720型)、NanoDrop ND-1000濃度測定儀(美國Thermo)、RT-qPCR儀(ABI 7500型)、普通PCR儀(ABI 2720型)、凝膠成像系統(tǒng)(Infinity 3026型，法國Vilber)等。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco)、胎牛血清(美國Gibco)、碳酸氫鈉(美國Sigma)、青鏈霉素(美國Gibco)、兩性霉素B(美國Amresco)、表皮生長因子(美國Gibco)、催乳素(美國Sigma)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(美國Gibco)、皮質(zhì)醇(美國Sigma)、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國 Thermo)、重組牛 GH(美國RayBiotech)、重 組 IGF-Ⅰ (美 國 Peprotech)、RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScripRT Master Mix(日本 TaKa-Ra)、SYBPremix Ex TaqTMⅡ(日本 TaKaRa)、Takara TaqTM試劑盒(日本TaKaRa)等。

1.1.3 細胞來源

乳腺組織來自揚州大學實驗農(nóng)牧場提供的泌乳中后期健康中國荷斯坦奶牛，運用手術(shù)法活體采集5 g左右乳腺組織進行乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)采用膠原酶消化法進行，傳代及純化過程中用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)除去成纖維細胞。得到的純?nèi)橄偕掀ぜ毎脙龃嬉河?70℃凍存待用。

1.2 試驗設(shè)計

取凍存的奶牛乳腺上皮細胞進行復蘇，加入生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清，并補充100 U/mL青鏈霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、1 μg/mL催乳素、1 μg/mL 胰島素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白 -硒、500 ng/mL氫化可的松以及10 ng/mL表皮生長因子)，按照5×104個/mL的密度接種到6孔板中，每孔2 mL。24 h細胞貼壁后，用PBS洗滌各孔2次，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細胞16 h，再用PBS洗滌各孔2次，然后按照如下方案對細胞處理24 h:對照組采用無血清生長培養(yǎng)基;GH組采用無血清生長培養(yǎng)基+GH(100 ng/mL);IGF-Ⅰ組采用無血清生長培養(yǎng)基+IGF-Ⅰ(100 ng/mL);GH+IGF-Ⅰ組采用無血清生長培養(yǎng)基 +GH(100 ng/mL)+IGF-Ⅰ(100 ng/mL)]，每孔加2 mL培養(yǎng)基，每個處理設(shè)3個重復，每孔為1個重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞總RNA的提取

細胞處理完成后，總RNA提取按照試劑盒說明書進行。用NanoDrop ND-1000核酸蛋白測定儀測定提取的總RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳測定其完整性?？俁NA于-70℃保存，待反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

1.3.3 PCR檢測GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達

PCR反應(yīng)使用Takara TaqTM試劑盒于普通PCR儀上進行。按照試劑盒說明配制反應(yīng)液:TaKaRa Taq(5 U/μL)0.25 μL、10 × PCR 緩沖液(含 Mg2+)5 μL、dNTP 4 μL、模板 cDNA 250 ng、上游和下游引物(20 μmol/L)各 1 μL;加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃ 5 min;94℃50 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個循環(huán);72 ℃10 min。PCR反應(yīng)中引物序列見表1。GHR引物參照文獻[24]，IGF-ⅠR引物采用 Primer 3引物設(shè)計程序設(shè)計。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察結(jié)果。

表1 GHR和IGF-ⅠR基因引物序列Table1 Sequences of primers for GHR and IGF-ⅠR genes

1.3.4 RT-qPCR法測定mRNA表達量

通過熔解曲線和1%瓊脂糖凝膠電泳判定PCR反應(yīng)的特異性。

以GAPDH為內(nèi)參基因計算各基因的mRNA表達量，計算公式[26]為:

式中:E目的基因和 E內(nèi)參基因分別為該基因的 PCR擴增效率;Ct為閾值循環(huán)。PCR擴增效率通過LinReg PCR 11.0 軟件計算[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SAS 9.1軟件ANOVA程序進行統(tǒng)計分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計的最終結(jié)果以平均值±標準誤的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 復蘇后奶牛乳腺上皮細胞貼壁與增殖情況

復蘇后的奶牛乳腺上皮細胞在生長培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h大部分已貼壁(圖1)，細胞成活率達90%以上，并保持了較高的增殖活性，凍存的奶牛乳腺上皮細胞經(jīng)過復蘇可以用于后續(xù)的試驗。

2.2 總RNA提取

從奶牛乳腺上皮細胞中提取的總RNA經(jīng)測定，各樣本 OD260nm/OD280nm均介于1.9～2.1之間，表明總RNA純度較高。另外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明總RNA完整性較好。總之，總RNA樣本質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗。

2.3 GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳觀察到與目的片段大小相吻合的條帶(圖2)，且無雜帶產(chǎn)生，表明該試驗中體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞能夠表達 GHR和 IGF-ⅠR mRNA，GH和 IGF-Ⅰ通過作用于乳腺上皮細胞上的相應(yīng)的受體來發(fā)揮各自的作用。

2.4 GH和IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA表達量的影響

由圖3可見，在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上單獨添加100 ng/mL的GH或IGF-Ⅰ均能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達量(P＜0.05)，二者聯(lián)合添加也能顯著促進κ-酪蛋白mRNA的表達(P＜0.05)，但與2個單獨添加組差異不顯著(P＞0.05)。

RT-qPCR熔解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果表明無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，且擴增產(chǎn)物大小與目的基因的片段大小相符合，表明較準確地對κ-酪蛋白mRNA的表達進行了相對定量。

表2 RT-qPCR各基因引物序列Table2 Sequences of primers for the RT-qPCR

圖1 復蘇后的奶牛乳腺上皮細胞貼壁和生長狀況Fig.1 Status of adherence and growth of bovine mammary epithelial cells after resuscitated

2.5 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達量的影響

由表3可見，在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細胞補充 GH、IGF-Ⅰ或 GH+IGF-Ⅰ，處理 24 h 后對 JAK2、STAT5、4EBP1、真核生物起始因子4E(eIF4E)、真核生物延伸因子2(eEF2)mRNA的表達量沒有顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比，GH組ELF5 mRNA表達量有提高的趨勢(P＜0.10)。IGF-Ⅰ組哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖體蛋白S6激酶1(rpS6K1)mRNA的表達量顯著提高(P＜0.05)。盡管GH+IGF-Ⅰ組rpS6K1 mRNA表達量顯著提高(P＜0.05)，但其表達量與IGF-Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05)。

各基因RT-qPCR反應(yīng)熔解曲線均為單一峰，無任何雜峰出現(xiàn)，此外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各基因擴增產(chǎn)物均為單一條帶，且符合擴增產(chǎn)物大小，表明RT-qPCR過程中無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，較準確地定量了各基因mRNA的表達量。

圖2 GHR和IGF-ⅠR基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram for PCR products of GHR and IGF-ⅠR genes

圖3 κ-酪蛋白mRNA表達量Fig.3 The mRNA expression level of CSN3

3 討論

3.1 GH和IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA表達量的影響

乳蛋白主要由酪蛋白(αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白)和清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)組成，為了解釋GH和IGF-Ⅰ促進乳蛋白合成的機理，許多國外學者做了相關(guān)的研究，Yang等[20]和Sakamoto等[19]于同年分別發(fā)現(xiàn)了GH對奶牛乳腺組織β-酪蛋白基因表達的促進作用和GH提高奶牛乳腺上皮細胞αs1-酪蛋白基因表達、蛋白合成的作用，同時用免疫組化法檢測到了GHR基因的表達，近年來，Johnson等[28]在奶牛乳腺上皮細胞系MAC-T細胞上也發(fā)現(xiàn)GH可提高αs1-酪蛋白基因表達量，此外還發(fā)現(xiàn)GH可促進α-乳白蛋白基因的表達，同時在MAC-T細胞上檢測到了GHR基因的表達。原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞多次經(jīng)過傳代后，αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白基因表達量均有所下降，但κ-酪蛋白基因表達量比其他酪蛋白更穩(wěn)定，此外，κ-酪蛋白是4種酪蛋白中的一種極其重要的種類，它不但能促進酪蛋白膠束的形成，還影響乳的許多物理特性[29]，κ-酪蛋白的糖基化程度可影響泌乳量、蛋白和酪蛋白含量[30]，κ-酪蛋白基因敲除的小鼠乳酪蛋白膠束不穩(wěn)定且不能泌乳[31]。鑒于κ-酪蛋白的重要性及其基因表達的穩(wěn)定性，本試驗選擇了κ-酪蛋白為研究對象，發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進κ-酪蛋白基因的表達，這與Zhou等[24]的研究結(jié)果不一致，他們發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進αs1-、αs2-、β-酪蛋白以及α-乳白蛋白基因的表達，κ-酪蛋白基因的表達有所提高但差異不顯著，原因可能與細胞來源和處理方式的不同有關(guān)，Zhou等[24]利用的是轉(zhuǎn)染了GHR和STAT5基因的MAC-T細胞且處理方式為單一添加GH，而本試驗則是用從奶牛乳腺組織中分離培養(yǎng)并傳代純化后的奶牛乳腺上皮細胞，處理方式是在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加GH。關(guān)于IGF-Ⅰ對酪蛋白基因表達量的研究尚未見報道，Burgos等[21]近年來報道了 IGF-Ⅰ能顯著促進MAC-T細胞總蛋白的合成，而本試驗首次發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達量。與對照組相比，GH和IGF-Ⅰ同時添加到無血清生長培養(yǎng)基中顯著促進了κ-酪蛋白mRNA表達，但未發(fā)現(xiàn)協(xié)同或累積效應(yīng)，聯(lián)合添加GH與IGF-Ⅰ與單獨添加GH或IGF-Ⅰ促進κ-酪蛋白mRNA表達的效果差異不顯著。另外，本試驗檢測到了GHR和IGF-ⅠR mRNA在奶牛乳腺上皮細胞中的表達，表明GH和IGF-Ⅰ通過與細胞受體結(jié)合激活胞內(nèi)信號通路，進而促進酪蛋白的表達。

表3 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達量的影響Table3 Effects of GH and IGF-Ⅰon mRNA expression levels of key kinases and factors regulating milk protein synthesis

3.2 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄可受到JAK2-STAT5信號通路的調(diào)節(jié)，而JAK2-STAT5信號通路可能是多種激素的共同作用路徑。當胞內(nèi)激素受體與激素結(jié)合后發(fā)生二聚，引起交叉磷酸化，使得JAK2被激活并發(fā)生酪氨酸磷酸化，為STAT5提供停留位點，進而使STAT5在JAK2的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化的STAT5發(fā)生二聚移向細胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA結(jié)合，激活乳蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄[32-33]。另外，該信號通路對于乳腺發(fā)育、乳腺上皮細胞的增殖與分化也發(fā)揮重要作用，無JAK2的小鼠在分娩時不但不能形成分泌腺泡而且激素誘導的細胞增殖嚴重減少[34]。反芻動物與嚙齒類動物不同，乳蛋白基因的高表達并非主要通過催乳素調(diào)控STAT5活性來實現(xiàn)，GH和IGF-Ⅰ可能也發(fā)揮了很大的作用[35]。一方面，GH和IGF-Ⅰ也可以調(diào)控STAT5-DNA結(jié)合活性。高濃度或生理范圍的催乳素、GH或IGF-Ⅰ均能提高體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織的STAT5-DNA結(jié)合活性，同時添加GH和催乳素的奶牛乳腺組織的STAT5活性顯著高于單一添加其中一種激素[36]。另一方面，GH和IGF-Ⅰ可能對STAT5的基因表達和蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響。Boutinaud等[37]給奶山羊每日外源補充GH，23 d后發(fā)現(xiàn)GH顯著提高了乳腺STAT5蛋白合成量和基因表達量，而本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加GH和IGF-Ⅰ在24 h內(nèi)不影響奶牛乳腺上皮細胞JAK2和STAT5 mRNA的表達。Yang等[36]也發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在短時間內(nèi)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織STAT5蛋白豐度沒有影響，因此GH和IGF-Ⅰ對STAT5基因表達和STAT5蛋白合成產(chǎn)生明顯作用可能需要較長的作用時間，而短時間內(nèi)它們可促進STAT5-DNA結(jié)合活性。ELF5屬于ETS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，它不但能夠調(diào)控乳腺細胞JAK2-STAT5信號通路，明顯促進STAT5活性，而且它自身的基因表達也受到STAT5的調(diào)控[38-39]。缺少ELF5基因的小鼠乳腺STAT5的基因表達量和蛋白活性降低[40]，進而引起小鼠乳蛋白合成的下降[41]，這可能是因為ELF5可通過抑制細胞因子信號抑制物(SOCS)基因表達來提高STAT5的活性[40]。雖然在奶牛乳腺組織上也發(fā)現(xiàn)了ELF5對乳蛋白合成起重要作用[24]，但關(guān)于GH和IGF-Ⅰ對ELF5基因表達量的影響到目前尚未見報道，本試驗發(fā)現(xiàn)盡管GH在24 h內(nèi)沒有顯著促進ELF5 mRNA的表達，但有提高其表達量的趨勢，沒有進一步影響到STAT5 mRNA的表達。

3.3 GH和IGF-Ⅰ對乳蛋白翻譯的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

mTOR信號通路在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成上的作用已被廣泛證實，其下游靶標rpS6K1、4EBP1、eEF2等在蛋白質(zhì)翻譯起始或延伸過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。mTOR通過提高rpS6K1的活性促使核糖體蛋白S6發(fā)生磷酸化進而促進蛋白質(zhì)翻譯起始和延伸的進行[42-43];通過促進 4EBP1磷酸化使eIF4E得以解離并與真核生物起始因子4G(eIF4G)、真核生物起始因子4A(eIF4A)等起始因子等形成eIF4F起始復合物，啟動含帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始[44];eEF2受到 eEF2激酶的調(diào)節(jié)，rpS6K1可使其下游的eEF2激酶發(fā)生磷酸化以抑制eEF2激酶活性，這有利于eEF2發(fā)生去磷酸化，進而使翻譯延伸能夠順利進行[42]。前人在奶牛乳腺上的研究已發(fā)現(xiàn)了rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 等對乳蛋白合成有重要作用[23，45-47]?；谶@些研究的基礎(chǔ)之上，本試驗選擇了在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E 和 eEF2，觀察它們的 mRNA表達量是否受到GH和IGF-Ⅰ的影響。研究結(jié)果表明在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細胞補充GH沒有顯著影響mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 mRNA 的表達量，這與Hayashi等[16]的奶牛體內(nèi)研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)給奶牛皮下注射GH顯著提高了乳蛋白產(chǎn)量及奶牛乳腺 eIF4E和 eEF2的蛋白豐度，但eIF4E、mTOR和 eEF2 mRNA表達量未受影響。GH可能在調(diào)控mTOR下游靶標磷酸化水平上有重要作用，因為在肝癌細胞上的研究證明了mTOR信號通路在GH對蛋白質(zhì)合成的快速激活中發(fā)揮重要作用，且能促進mTOR下游靶標的磷酸化[48]，但在乳腺上皮細胞上是否存在同樣的作用需要進一步的研究。Burgos等[21]以奶牛乳腺上皮細胞系MAC-T細胞為研究模型，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ在顯著提高蛋白質(zhì)合成同時顯著提高了S6K1、4EBP1磷酸化水平以及eIF4G與eIF4E的結(jié)合量，并顯著降低4EBP1與eIF4E的結(jié)合量，而IGF-Ⅰ是否影響奶牛乳腺上皮細胞mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2基因的表達量尚未見報道，在本試驗條件下IGF-Ⅰ顯著促進了mTOR和rpS6K1 mRNA的表達量，其他基因未受到影響。研究發(fā)現(xiàn)GH可通過抑制胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)基因的表達，降低 IGFBP-5對 IGF-Ⅰ的高親和力來促進IGF-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細胞的作用[49]，表明GH和IGF-Ⅰ存在一定的協(xié)同作用，而本試驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合添加GH和IGF-Ⅰ雖能顯著提高rpS6K1 mRNA的表達量，但與單獨添加IGF-Ⅰ產(chǎn)生的作用差異不顯著，另外GH+IGF-Ⅰ對κ-酪蛋白mRNA的表達量也未發(fā)現(xiàn)累積效應(yīng)，因此GH和IGF-Ⅰ對乳腺上皮細胞的協(xié)同作用可能表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡方面，這尚需進一步的研究。綜合前人和本試驗的研究結(jié)果，GH和IGF-Ⅰ可能在基因表達、蛋白豐度以及磷酸化水平多個層次下調(diào)控參與調(diào)節(jié)乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子，進而促進乳蛋白的合成，但具體的調(diào)節(jié)機理仍需進一步通過大量的體內(nèi)外試驗研究來確證。

4 結(jié)論

①在無血清生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞補充GH和IGF-Ⅰ能夠顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達量，這是GH和IGF-Ⅰ通過分別作用于其受體來激活胞內(nèi)信號通路實現(xiàn)的，但未發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在促進κ-酪蛋白mRNA表達量方面存在聯(lián)合效應(yīng)。

②在本試驗條件下，單獨補充GH有促進ELF5 mRNA表達量的趨勢;單獨添加IGF-Ⅰ可顯著提高mTOR和rpS6K1 mRNA表達量，但GH沒有進一步加強IGF-Ⅰ的這種作用，表明 GH和IGF-Ⅰ可單獨通過影響調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶及調(diào)節(jié)因子基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)κ-酪蛋白的合成。

致謝:

感謝揚州大學獸醫(yī)學院李建基教授、王亨副教授在奶牛乳腺手術(shù)活體采樣上給予的大力幫助;感謝徐柏林碩士在奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)技術(shù)上給予的耐心指導。

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