欒兆雙 宋 娟 胡彩虹

(浙江大學飼料科學研究所，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州 310058)

腸道是機體與外界環(huán)境接觸最為密切的部位，不僅是消化、吸收營養(yǎng)物質的重要場所，而且是機體的重要免疫屏障。腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個病理機制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號道路的調節(jié)有關。MAPK信號通路是廣泛存在于真核生物中保守的信號轉導系統(tǒng)，MAPK被激活后可停留在胞質中，激活一系列其他蛋白激酶，亦可進入細胞核調節(jié)相應基因的表達，完成對細胞外刺激的反應。MAPK參與調節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程[1-3]。目前已在哺乳動物細胞克隆和鑒定了4個MAPK亞族:胞外信號調節(jié)激酶 1/2(external-signal regulated kinase，ERK1/2)、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 MAPK和胞外信號調節(jié)激酶5(ERK5)。Broom 等[2]報道，炎癥性腸疾病引起ERK1/2、p38 MAPK被激活，MAPK激活時間、程度與腸損傷時間、程度一致。大量研究表明，斷奶應激使仔豬腸形態(tài)受損，消化吸收能力下降[4]，并且使仔豬腸道的通透性增加，破壞腸屏障功能[5-6]。然而關于早期斷奶應激引起仔豬腸道損傷的信號轉導機制尚不清楚[7]。MAPK是否參與此過程目前尚未見報道。本試驗通過MAPK信號通路抑制劑預處理斷奶仔豬，旨在研究阻斷p38 MAPK、JNK和ERK信號通路對斷奶仔豬小腸形態(tài)和腸通透性的影響，為防治仔豬早期斷奶應激引起的腸道損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗選用體重約為5.8 kg的24頭21日齡杜×長×大斷奶仔豬，隨機分成4組，每組6頭。試驗組斷奶前30 min分別腹腔注射p38 MAPK抑制劑(2 mg/kg SB203580，Ⅰ組)、JNK 抑制劑(4 mg/kg SP600125，Ⅱ組)和 ERK1/2抑制劑(2 mg/kg PD98059，Ⅲ組)，對照組注射等量的生理鹽水。仔豬自由采食和飲水，按常規(guī)程序進行管理。于斷奶后36 h屠宰仔豬取樣待測。

1.2 飼糧及營養(yǎng)水平

基礎飼糧參照美國NRC(1998)斷奶仔豬的營養(yǎng)需要配合成顆粒飼料。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣品采集與測定

仔豬早晨空腹前腔靜脈取血，肝素抗凝，制備血漿，-80℃保存。屠宰后，沿腸系膜縱向切開小腸，取空腸中段長度約1 cm的腸管，浸入10%福爾馬林固定液中4℃保存。另取10 cm左右空腸用剪刀剖開，用生理鹽水輕輕沖洗腸內容物，用濾紙吸干水分，再用手術刀鈍面輕輕刮取腸黏膜，分裝在5 mL無菌凍存管中，液氮速凍，-80℃保存。

1.3.1 小腸形態(tài)分析

用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。Leica Qwin圖像分析儀測定絨毛高度和隱窩深度。

1.3.2 腸通透性

血漿D-乳酸含量測定參照Brandt等[8]建立的分光光度法。血漿二胺氧化酶(DAO)含量用豬DAO ELISA試劑盒(Uscn Life Science公司，美國)測定。

1.3.3 小腸黏膜促炎細胞因子水平

稱取一定量黏膜，按1∶9加入磷酸鹽緩沖液，勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，制備成10%的黏膜勻漿液，促炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素 1β(IL-1β)、白細胞介素 6(IL-6)和干擾素γ(IFN-γ)水平采用ELISA試劑盒(R＆D System，美國)測定。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.4 數據統(tǒng)計

數據計算程序采用SAS 6.12中的一般線性模型(general linear models)進行，平均值的比較采用Duncan氏法進行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 空腸形態(tài)

由表2可知，Ⅰ組絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度均高于對照組(P＜0.05)，隱窩深度顯著低于對照組(P＜0.05);與對照組相比，Ⅱ組絨毛高度/隱窩深度顯著提高(P＜0.05)，而Ⅲ組各指標均未顯著變化(P＞0.05)。

表2 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響Table2 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on jejunal morphology of weaner piglets

2.2 腸通透性

由表3可知，與對照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組仔豬血漿D-乳酸、DAO含量顯著降低(P＜0.05)，Ⅰ組降低程度較大，而Ⅲ組仔豬血漿D-乳酸含量顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬腸通透性的影響Table3 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on intestinal permeability of weaner piglets

2.3 空腸黏膜細胞因子

由表4可知，Ⅰ組空腸黏膜促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-γ 水平顯著低于對照組(P＜0.05);與對照組相比，Ⅱ組TNF-α和 IL-1β水平顯著降低(P＜0.05)，IL-6和IFN-γ水平均未顯著變化(P＞0.05)，而Ⅲ組TNF-α水平顯著升高(P＜0.05)，IL-6和IFN-γ水平有上升的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。

表4 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬空腸黏膜促炎細胞因子的影響Table4 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on jejunum mucosal pro-inflammatory cytokines of weaner piglets pg/mg prot

3 討論

MAPK信號轉導途徑是細胞內多條信號通路的匯聚點，包括蛋白激酶C、離子通道等，它介導了細胞的生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種細胞生理過程。p38 MAPK和JNK均是應激激活的MAPK，能被炎癥、應激、損傷等信號激活[1-2，10]。p38 MAPK 和 JNK 信號轉導通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用。

D-乳酸是胃腸道固有細菌的代謝終產物，哺乳動物體內不具備將其快速代謝分解的酶系統(tǒng)，因而血漿中D-乳酸含量的增加可反映腸通透性的改變。DAO是哺乳動物腸絨毛上皮細胞的標記酶，其活性與絨毛高度和黏膜細胞的核酸和蛋白質合成密切相關，可作為反映腸黏膜屏障功能損傷的理想指標[9]。早期斷奶應激會引起仔豬腸形態(tài)發(fā)生改變，主要表現為絨毛高度下降，隱窩深度加深，腸絨毛上成熟細胞數量減少，且黏膜的消化酶活性下降[11-12]，從而造成仔豬腸道消化吸收面積減少，消化能力下降，使仔豬腸道屏障功能受損[4，13-14]。前期作者研究了早期斷奶對仔豬腸黏膜屏障變化以及p38 MAPK信號通路的影響，結果表明，與哺乳組相比，21日齡仔豬斷奶后24和48 h小腸形態(tài)和黏膜屏障受損，斷奶應激激活了p38 MAPK信號通路[15]。本試驗發(fā)現，與對照組相比，斷奶前腹腔注射p38 MAPK和JNK抑制劑，仔豬小腸形態(tài)得到明顯的改善，腸道通透性顯著降低(血漿 D-乳酸、DAO含量顯著降低)，p38 MAPK抑制劑效果較明顯。p38 MAPK能激活細胞內一些蛋白激酶，進而激活低分子質量熱休克蛋白27(HSP27)，介導細胞骨架重構以及促進腸損傷后上皮細胞存活、增殖和修復過程[1]。本試驗中p38 MAPK抑制劑處理后有較好的腸道改善效果可能與此有關。

細胞因子在腸黏膜免疫應答中起重要作用，而且還參與維持上皮組織的完整性。斷奶因飼糧和環(huán)境的突然變化而產生的應激引起仔豬腸道細胞因子網絡發(fā)生改變，以適應腸道在形態(tài)學和功能上的變化。Pie等[16]研究發(fā)現，28日齡斷奶使仔豬腸黏膜免疫系統(tǒng)產生早期的、暫時性的炎癥應答，在小腸中部，TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 等表達水平在斷奶后的前2天內迅速增加，隨后恢復到斷奶前水平。p38 MAPK的激活與炎癥反應密切相關，調節(jié)多種炎性細胞因子基因表達，調控炎癥反應[17]。本試驗發(fā)現，與對照組相比，斷奶前腹腔注射p38 MAPK和JNK抑制劑仔豬小腸促炎細胞因子表達量顯著降低，p38 MAPK抑制劑效果較明顯。Mihaescu 等[18]報道，ERK1/2、JNK、p38 MAPK參與輻射導致的腸黏膜損傷，用特異性p38 MAPK抑制劑SB203580抑制p38 MAPK活性，可明顯減少TNF-α釋放，減輕腸黏膜組織損傷。還有學者利用Caco-2、T84等細胞模型，研究了促炎因子TNF-α、IFN-γ等對腸通透性的影響，結果發(fā)現促炎因子可通過改變腸上皮細胞緊密連接蛋白的基因表達和分布，破壞緊密連接，進而增加腸道通透性[19]。提示用p38 MAPK和JNK抑制劑抑制信號通路，可能通過抑制炎癥細胞因子的表達，減輕仔豬腸道炎癥，從而保護腸黏膜屏障。其中具體的機制有待進一步的研究。

ERK1/2通路在促進腸上皮細胞增生和分化中發(fā)揮重要作用。本試驗結果表明，斷奶前注射ERK1/2抑制劑仔豬腸屏障沒有得到改善，反而有加重損傷的趨勢。Basuroy等[20]在研究過氧化氫(H2O2)誘導Caco-2細胞氧化應激過程中發(fā)現，緊密連接蛋白重新分布，細胞骨架被破壞，細胞通透性增加，而上皮生長因子可以通過激活ERK1/2通路保護緊密連接蛋白，保護腸黏膜;用ERK1/2抑制劑處理后，上皮生長因子的保護作用被阻斷。ERK1/2信號通路在小腸損傷修復過程中發(fā)揮著重要作用[21]。提示在斷奶應激致仔豬腸屏障損傷過程中ERK信號通路的激活可能起到一定的修復保護作用。

4 結論

在斷奶應激致仔豬小腸黏膜屏障受損過程中，抑制p38 MAPK和JNK通路后，腸屏障得到改善，而抑制ERK1/2通路后腸屏障損傷有加重的趨勢。

致謝:

感謝美國北卡羅琳娜州立大學(North Carolina State University)獸醫(yī)學院Moeser博士對本試驗選題、構思和論文撰寫給予的指導。

[1]鄭曙云，付小兵，徐建國.MAPK信號傳導通路與腸損傷后黏膜上皮修復[J].中國危重病急救醫(yī)學，2004，16(1):59-62.

[2]BROOM O J，WIDJAYA B，TROELSEN J，et al.Mitogen activated protein kinases:a role in inflammatory bowel disease?[J].Clinical＆ Experimental Immunology，2009，158(3):272-280.

[3]COSTANTINI T W，PETERSON C Y，KROLL L，etal.Role of p38 MAPK in burn-induced intestinal barrier breakdown[J].Journal of Surgical Research，2009，156(1):64-69.

[4]LALLèS J P，BOSI P，SMIDT H，et al.Weaning:a challenge to gut physiologists[J].Livestock Science，2007，108(1/2/3):82-93.

[5]劉海萍，胡彩虹，徐勇.早期斷奶對仔豬腸通透性和腸上皮緊密連接蛋白Occludin mRNA表達的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2008，20(4):442-446.

[6]HU C H，SONG J，YOU Z T，et al.Zinc oxide-montmorillonite hybrid influences diarrhea，intestinal mucosal integrity and digestive enzyme activity in weaned pigs[J].Biological Trace Element Research，2011.doi:10.1007/s12011-012-9422-9.

[7]MOESER A J，VANDER K C，RYAN K A，et al.Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig[J].American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2007，292(1):G173-G181.

[8]BRANDT R B，SIEGEL S A，WATERS M G，et al.Spectrophotometric assay for D-lactate in plasma[J].Analytical Biochemistry，1980，102(1):39-46.

[9]胡泉舟，侯永清，王猛.血中二胺氧化酶活性與仔豬腹瀉程度的相關性分析[J].豬業(yè)科學，2007(12):73-74.

[10]KYRIAKIS J M，BANERJEE P，NIKOLAKAKI E，et al.The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases[J].Nature，1994，369:156-160.

[11]HEDEMANN M S，DYBKJAER L，JENSEN B B.Pre-weaning eating activity and morphological parameters in the small and large intestine of piglets[J].Livestock Science，2007，108(1/2/3):128-131.

[12]HEDEMANN M S，H?JSGAARD S，JENSEN B B.Small intestinal morphology and activity of intestinal peptidases in piglets around weaning[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2003，87(1/2):32-41.

[13]WIJTTEN P J A，MEULEN J V D，VERSTEGEN M W A.Intestinal barrier function and absorption in pigs after weaning:a review[J].British Journal of Nutrition，2011，105:967-981.

[14]SMITH F，CLARK J E，OVERMAN B L，et al.Early weaning stress impairs development of mucosal barrier function in the porcine intestine[J].American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2010，298:G352-G363.

[15]欒兆雙，姚麗麗，傅振寧，等.斷奶應激對仔豬腸形態(tài)、腸黏膜屏障和p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2012，24(11):2237-2242.

[16]PIé S，LALLèS J P，BLAZY F，et al.Weaning is associated with an upregulation of expression of inflammatory cytokines in the intestine of piglets[J].The Journal of Nutrition，2004，134:641-647.

[17]易文全，甘華田.P38 MAPK信號通路:炎性腸病治療的新靶[J].華西醫(yī)學，2006，21(1):194-195.

[18]MIHAESCU A，SANTEN S，JEPPSSON B，et al.P38 mitogen-activated protein kinase signalling regulates vascular inflammation and epithelial barrier dysfunction in an experimental model of radiation-induced colitis[J].British Journal of Surgery，2010，97(2):226-234.

[19]CAPALDO C T，NUSRAT A.Cytokine regulation of tight junctions[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1788(4):864-871.

[20]BASUROY S，SETH A，ELIAS B，et al.MAPK interacts with occludin and mediates EGF-induced prevention of tight junction disruption by hydrogen peroxide[J].Biochemical Journal，2006，(393):69-77.

[21]余進.豬和大鼠小腸黏膜熱應激損傷修復機制的研究[D].碩士學位論文.北京:北京農學院，2010:57-69.