陳元元 朱宇旌 張 勇

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866)

紫花苜蓿是世界上栽培面積最廣的豆科牧草之一，具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、抗風(fēng)沙等特點。苜蓿干物質(zhì)含量可達(dá)10% ～15%，粗蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，氨基酸平衡。苜蓿多糖(alfalfa polysaccharides，APS)是從紫花苜蓿中提取的具有生物活性的植物多糖，是苜蓿的重要營養(yǎng)成分，無毒性，可提高畜禽免疫功能，應(yīng)用于畜禽飼料可避免抗生素帶來的耐藥性及藥物殘留等問題，具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益，因此，將APS開發(fā)為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽飼料具有重要意義。

1 APS的結(jié)構(gòu)

APS是由酸溶性碳水化合物構(gòu)成的酸性多糖，成分為葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一種未知單糖，不含蛋白質(zhì)和淀粉。超濾法測得其分子質(zhì)量為 20 ～60 ku[1]。

2 APS的提取

APS為水溶性非淀粉多糖，難溶于乙醇，性質(zhì)穩(wěn)定，主要提取方法有醇提法和水煮法，考慮到操作簡單和節(jié)約試劑成本，多選用水煮法提取。試驗得出APS的最佳提取條件為:溫度100℃，料水比1∶40 ～1∶20，浸提時間 1 ～2 h，醇析時乙醇濃度為80% ～95%[2]，具體條件受苜蓿品種、茬次和試驗條件等因素影響。超聲波輔助可使溫度降低到70～80℃，浸提時間縮短到20～30 min，并可提高提取率[3]。

3 APS的純化與純度鑒定

水煮法得到的APS含較多雜質(zhì)，其中蛋白質(zhì)成分居多，實驗室中最常用的多糖脫蛋白質(zhì)方法是savage法，最常用的多糖分級與純化采用Sephadex凝膠柱層析法。Sephadex是一種葡萄糖凝膠，A系列Sephadex利用不同多糖分子與其吸附程度不同的原理，對樣品進(jìn)行分級和純化。G系列Sephadex依據(jù)各種多糖分子質(zhì)量的不同而將其分開。APS分離出AP1、AP2、AP3和AP4 4個組分，其中AP2和AP3是主要成分，二者都為均一多糖。AP2-a和AP3-b 2種組分純度較高，不含蛋白質(zhì)、多肽、核酸、糖醛酸、淀粉等雜質(zhì)，不含還原糖、單糖和二糖，它們的物理性質(zhì)均為白色粉末，易溶于熱水，較難溶于冷水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇等有機溶劑，黏度較大，氣味清香，平均分子質(zhì)量分別為15 019和20 739 u，活性范圍在10 000～2 000 000 U，均屬活性多糖。AP2-a中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖及吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，AP3-b中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖和D-鼠李糖及吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，其中D-吡喃葡萄糖是與免疫、抗氧化和抗腫瘤等生物活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)。

4 APS的生物學(xué)功能

4.1 APS的免疫調(diào)節(jié)功能

植物多糖具有廣泛的生物活性，普遍具有免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]。免疫器官的發(fā)育狀況可直接影響機體免疫應(yīng)答水平、抵抗外來微生物感染和侵入的能力[6]。試驗證明，APS能不同程度地促進(jìn)畜禽免疫器官胸腺、法氏囊、脾臟、盲腸、扁桃體的發(fā)育，延緩胸腺的萎縮[7]，還能促進(jìn)肉雞腸道后段有益菌的生長，特別是乳酸菌，抑制埃希大腸桿菌的增殖，增強機體的抵抗力[8]。APS還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，增強細(xì)胞免疫功能[9]。在體外APS能夠刺激植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和PWM培養(yǎng)液誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，說明APS有縮短細(xì)胞周期、顯著提高T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的作用，它還能增強由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫能力，對自然殺傷細(xì)胞(NK)的活化有影響[10]。另有試驗證明，紅細(xì)胞通過其表面的C3b受體與抗原-抗體-補體免疫復(fù)合物(CIC)結(jié)合而發(fā)揮清除CIC和促進(jìn)吞噬的作用，增加紅細(xì)胞免疫功能，說明APS對雞紅細(xì)胞免疫功能具有繼發(fā)增強作用。APS還能糾正環(huán)磷酰胺對抗體形成細(xì)胞的抑制作用，在增強機體防御能力的同時快速消滅病原體，清除機體內(nèi)的衰老死亡細(xì)胞[11]。研究表明，APS可能通過抗原遞呈細(xì)胞(APCs)對抗惡性細(xì)胞或惡性細(xì)胞碎片，抗原肽在APCs上結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ或Ⅱ，MHCⅠ分子的抗原肽激活早期細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)，而MHCⅡ分子的抗原肽激活早期輔助性T細(xì)胞(CD4+)，T輔助細(xì)胞1(Th1)產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括白介素2(IL-2)和干擾素 γ(IFN-γ)，這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的激活，激活NK和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)產(chǎn)生(圖1)[12]，所以 APS 可顯著促進(jìn)CD4+增殖和提高CD4+/CD8+，進(jìn)而起到免疫作用。APS還可提高機體的體液免疫功能，調(diào)節(jié)B細(xì)胞、CTL和M細(xì)胞等細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫球蛋白(Ig)類抗體含量的提高，促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生和白介素2受體(IL-2R)的基因表達(dá)，誘導(dǎo)白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子 α(TNF-α)的產(chǎn)生[13]。APS通過增強機體的免疫力，減少應(yīng)激，把與病變相關(guān)的無效免疫應(yīng)答降到最低限度，從而使?fàn)I養(yǎng)成分被充分利用，這可能是APS改善動物生長性能的機制之一[14]。

4.2 APS的抗氧化功能

機體的代謝產(chǎn)生過多自由基會引起病變甚至死亡，但自身防護(hù)系統(tǒng)對自由基的清除能力有限[15]，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用的合成抗氧化劑因其毒性而減少使用，植物多糖作為一種天然抗氧化生物活性化合物而備受關(guān)注。APS作為一種自由基清除劑，除了與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，它還可以通過激活內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)起到間接保護(hù)的作用，可能有2種作用機制:第一，APS可能與自由基直接反應(yīng)來提高抗氧化酶活性;第二，APS可能會影響抗氧化酶的基因表達(dá)，并調(diào)節(jié)特定酶的活動[16]。1，1-二苯基 -2-苦基苯肼(1，1-dipheyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和羥自由基是2個最有代表性的自由基。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，抗氧化劑將電子或氫原子轉(zhuǎn)移到DPPH，從而消除了DPPH的自由基性質(zhì)，抗氧化劑的抗氧化活性可通過對DPPH的抑制率表示，通過測試DPPH可以反映出自由基的清除程度。羥自由基是破壞性最強的自由基，它能通過所有需氧有機體形成和分解[17]，會導(dǎo)致任何主要生物分子(如DNA、蛋白質(zhì)、脂類和小細(xì)胞)的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心血管和神經(jīng)性疾病[18]。自由基生成引起老化是因為活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的增加和抗氧化防御的降低，前者主要是生物體正常細(xì)胞代謝的副產(chǎn)品，多產(chǎn)生于線粒體。ROS能引起脂質(zhì)過氧化、氨基酸殘基氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)形成DNA氧化損傷。正常生理條件下，ROS可以保護(hù)細(xì)胞的系統(tǒng)清除，但在某些病理條件下，ROS之間生成和消除動態(tài)平衡可能被打破，導(dǎo)致細(xì)胞ROS水平增加，高水平的ROS可能在各種細(xì)胞成分中發(fā)生氧化損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。正常的生物體內(nèi)都有其抗氧化防御的清除氧化劑，來防止ROS對細(xì)胞的損傷。如超氧化物歧化酶(SOD)是一種在線粒體中含有的，對活性氧進(jìn)行有效防御的酶，它能通過超氧陰離子自由基加速過氧化氫的形成，清除氧自由基。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可將過氧化氫和過氧化物分解為無毒的產(chǎn)品，并通過細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物終止脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SOD和GSH-Px的內(nèi)源性抗氧化酶可以將ROS轉(zhuǎn)化成更少的有毒化合物，超氧化物先由SOD分解成過氧化氫，隨后通過一系列包括GSH-Px的活性酶催化和轉(zhuǎn)化變成水。丙二醛(MDA)可通過監(jiān)測機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物反映自由基對組織細(xì)胞的損傷[20]。這些抗氧化酶能由脂質(zhì)過氧化物或自由基引起失活，從而導(dǎo)致其在氧化條件下通過各種條件誘導(dǎo)的毒性激活，ROS產(chǎn)量是評價活細(xì)胞的氧化損傷程度的直接指標(biāo)。研究表明，APS能清除ROS同時抑制自由基的產(chǎn)生[21]，還能夠提高SOD、GSH-Px活性，減少MDA的生成，進(jìn)而提高機體抗氧化能力[22-24]，保護(hù)機體正常細(xì)胞免受自由基攻擊，說明APS對機體有顯著的抗氧化作用，這也是它抗衰老、抗炎癥、降血脂、抗腫瘤等功效的藥理基礎(chǔ)[25]。在一定濃度下，APS清除DPPH及羥自由基的作用，隨濃度的增加而增強，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[26]，但因淋巴細(xì)胞中存在對多糖的反饋調(diào)節(jié)機制，所以并非其濃度越高抗氧化作用越好。另外，不同植物多糖的抗氧化效果不同，可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)[27]。

圖1 苜蓿多糖的免疫應(yīng)答和作用方式流程圖Fig.1 Schematic representation of immune responses and actions of APS[12]

4.3 APS的抗腫瘤功能

惡性腫瘤已成為威脅人類生存的主要疾病之一，多糖可進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，且無毒副作用。研究表明，多糖抗腫瘤的機制是通過刺激相關(guān)細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，強化或活化相關(guān)免疫細(xì)胞，提高TNF-α、超氧化物離子和IL-2等細(xì)胞因子含量。多糖抗腫瘤是通過提高機體的特異性或非特異性免疫功能，增強寄主自身的免疫力而發(fā)揮作用的。由相關(guān)試驗可知，APS抗腫瘤可能有3個主要作用機制(圖2):第一，通過抑制增加癌癥的免疫因子的產(chǎn)生或中和免疫因子提高宿主免疫力。第二，直接或通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生來激活免疫細(xì)胞。第三，直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MHCⅠ抗原的表達(dá)增強。這些機制是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的多糖抑制癌癥復(fù)發(fā)的理論依據(jù)。張東杰等[28]的試驗說明APS在一定程度上抑制了荷瘤小鼠體重的增加，延長了其生存期，對腫瘤的治療有幫助。

4.4 APS的抗感染功能

機體的宿主細(xì)胞抗菌防御系統(tǒng)遭到破壞時可能被細(xì)菌感染，另外細(xì)菌也能通過在宿主上皮黏膜表面定植來感染健康細(xì)胞。許多細(xì)菌可與宿主細(xì)胞表面的糖類結(jié)合，稱為黏附。細(xì)菌主要以長絲狀菌毛結(jié)構(gòu)黏附宿主細(xì)胞，菌毛從細(xì)菌細(xì)胞表面呈輻射狀，許多細(xì)菌毒素也由單個蛋白質(zhì)亞基聚集而成，每個亞基包含1個或多個糖類結(jié)合位點(圖3)。與細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似的糖類可通過競爭與宿主細(xì)胞結(jié)合而抑制細(xì)菌定植或黏膜上皮細(xì)胞中毒[29]。一般單個糖序列與蛋白質(zhì)結(jié)合能力很低，通過每個蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合點組成多聚體，可使糖類與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力顯著增加，這樣一種蛋白質(zhì)便可與同源寡聚多糖緊密結(jié)合。多糖抗感染就是通過多糖與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使細(xì)菌失去與宿主細(xì)胞結(jié)合的親和力，無法結(jié)合宿主細(xì)胞受體上的糖序列而抑制細(xì)菌感染的。

圖2 腫瘤微環(huán)境和苜蓿多糖的作用過程Fig.2 Tumor microenvironment and actions of APS[12]

圖3 細(xì)菌與宿主細(xì)胞表面結(jié)合Fig.3 The binding of microbes to cell surfaces of the host[29]

4.5 APS的其他功能

APS在一定劑量范圍內(nèi)對畜禽有明顯的促進(jìn)生長、增強免疫功能、抗氧化、抗感染的作用，對T細(xì)胞、B細(xì)胞活化有免疫增強作用，APS還有降血脂、降血糖、降血壓、解毒、抗血栓、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗輻射、抗疲勞、抗衰老、抗蟲、化感等作用[30]，另外APS還可治療高膽固醇，強化血管和預(yù)防動脈硬化、心肌梗塞等。

5 APS在畜禽飼料中的應(yīng)用

5.1 APS在肉雞上的應(yīng)用

APS可以提高畜禽抗病能力。郝永清等[10]用APS做肉仔雞疫苗佐劑進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示肉仔雞體內(nèi)抗體免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)水平提高，說明多糖可通過激活補體強化抗體作用，增強畜禽免疫功能，提高畜禽抗病能力。

APS可以促進(jìn)畜禽生長。夏素銀等[31]用肉仔雞進(jìn)行試驗，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0、0.5%、1.0%和2.0%APS，結(jié)果顯示添加APS 1%組增重高于0組，而2%組低于0組，1%組效果最好。說明添加APS能夠促進(jìn)畜禽生長但存在劑量效應(yīng)，適量添加APS可提高畜禽對飼糧的利用率，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;江振瑩等[32]試驗肉仔雞不同生長階段的體重測定結(jié)果顯示，APS可以促進(jìn)畜禽生長，其中1%添加組效果最好。

APS可以促進(jìn)畜禽免疫器官的發(fā)育。郝永清等[33]分別將APS通過不同途徑對肉仔雞進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示APS可促進(jìn)肉仔雞胸腺、法氏囊、脾臟、盲腸和扁桃體發(fā)育，說明APS能夠促進(jìn)畜禽免疫器官的發(fā)育。

APS可以促進(jìn)畜禽淋巴細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。劉晴雪等[34]分別將不同濃度的APS加入體外培養(yǎng)肉仔雞淋巴細(xì)胞，測定其增殖變化，結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞的吸光度值(OD)隨APS濃度增加先增高后降低;同濃度APS對不同器官淋巴細(xì)胞刺激程度不同，外周血和脾臟淋巴細(xì)胞OD低于胸腺和法氏囊;APS對外周血、脾臟、法氏囊和胸腺的最佳刺激濃度分別為 20、8、15 和 15 μg/mL。說明APS可通過刺激淋巴細(xì)胞的增殖提高畜禽的抗病能力。江振瑩等[32]分別添加0、1% 、8%APS 對肉仔雞進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示APS能使雞血清中雞新城疫抗體滴度提高，促進(jìn)細(xì)胞吞噬和轉(zhuǎn)化能力，8%添加組效果最好。郝永清等[33]將APS分別用肌注(2.5、5 和 10 mg/只)、加入疫苗(2.5、5 和10 mg/只)、飼料添加劑(0、10和80 mg/kg)3種不同方式對肉仔雞進(jìn)行試驗，在不同生長階段檢測外周血淋巴細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示APS可促進(jìn)肉仔雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞吞噬功能，提高血清中雞新城疫的抗體滴度。APS肌注5 mg/只組與配伍疫苗10 mg/只組和8%飼糧中添加組促進(jìn)免疫器官發(fā)育效果最好。說明APS能增強畜禽的細(xì)胞免疫功能，提高畜禽抗病能力。章世元等[35]分別用15、20和50 μg/mL APS對肉仔雞進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示適量APS可提高T細(xì)胞OD，促進(jìn)肉仔雞淋巴細(xì)胞增殖，20 μg/mL時效果最好，說明APS可促進(jìn)畜禽淋巴細(xì)胞增殖，且存在劑量效應(yīng)(表 1)。

表1 APS在肉雞上的應(yīng)用效果Table1 Application effects of APS on broilers

5.2 APS在仔豬上的應(yīng)用

張世軍等[36]將APS加入豬瘟兔化弱毒疫苗對仔豬進(jìn)行免疫和攻毒試驗，結(jié)果顯示試驗組仔豬外周血液的B細(xì)胞含量和IgG水平提高，仔豬發(fā)熱比對照組晚，時間短，程度輕，對豬瘟強毒抵抗力增強，比單一疫苗預(yù)防豬瘟效果好。說明APS可強化豬瘟疫苗免疫作用，且不會損害肝、心臟等臟器。

6 小結(jié)

我國苜蓿資源豐富，APS的原料成本相對較低，無毒副作用，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此倍受國內(nèi)外市場青睞。APS具有增強免疫力、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、降血脂、降血糖、解毒、抗菌、抗炎等作用，作為一種植物提取物，在一定劑量范圍內(nèi)增強畜禽免疫力，降低疾病死亡率，促進(jìn)動物生長，有利于提高動物繁殖與機體性能，現(xiàn)已在畜禽養(yǎng)殖中大量應(yīng)用。近年來隨著人們對食品安全、動物營養(yǎng)等各個領(lǐng)域重視度的不斷提高，APS在相關(guān)領(lǐng)域的作用日益凸顯。隨著多糖制備、結(jié)構(gòu)、合成研究的不斷深入，其應(yīng)用市場將更加廣闊。但是苜蓿產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化仍然存在一定問題:產(chǎn)業(yè)化投資需求大;市場對產(chǎn)品的數(shù)量要求大;科研投入不足等。另外APS分離提純的程序復(fù)雜，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不好控制，結(jié)構(gòu)測定也尚無一種有效方法，因此APS在畜禽飼料中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究與探索。

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