陳元元 朱宇旌 張 勇
(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,沈陽 110866)
紫花苜蓿是世界上栽培面積最廣的豆科牧草之一,具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、抗風(fēng)沙等特點(diǎn)。苜蓿干物質(zhì)含量可達(dá)10% ~15%,粗蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)含量豐富,氨基酸平衡。苜蓿多糖(alfalfa polysaccharides,APS)是從紫花苜蓿中提取的具有生物活性的植物多糖,是苜蓿的重要營養(yǎng)成分,無毒性,可提高畜禽免疫功能,應(yīng)用于畜禽飼料可避免抗生素帶來的耐藥性及藥物殘留等問題,具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益,因此,將APS開發(fā)為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽飼料具有重要意義。
APS是由酸溶性碳水化合物構(gòu)成的酸性多糖,成分為葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一種未知單糖,不含蛋白質(zhì)和淀粉。超濾法測(cè)得其分子質(zhì)量為 20 ~60 ku[1]。
APS為水溶性非淀粉多糖,難溶于乙醇,性質(zhì)穩(wěn)定,主要提取方法有醇提法和水煮法,考慮到操作簡單和節(jié)約試劑成本,多選用水煮法提取。試驗(yàn)得出APS的最佳提取條件為:溫度100℃,料水比1∶40 ~1∶20,浸提時(shí)間 1 ~2 h,醇析時(shí)乙醇濃度為80% ~95%[2],具體條件受苜蓿品種、茬次和試驗(yàn)條件等因素影響。超聲波輔助可使溫度降低到70~80℃,浸提時(shí)間縮短到20~30 min,并可提高提取率[3]。
水煮法得到的APS含較多雜質(zhì),其中蛋白質(zhì)成分居多,實(shí)驗(yàn)室中最常用的多糖脫蛋白質(zhì)方法是savage法,最常用的多糖分級(jí)與純化采用Sephadex凝膠柱層析法。Sephadex是一種葡萄糖凝膠,A系列Sephadex利用不同多糖分子與其吸附程度不同的原理,對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)和純化。G系列Sephadex依據(jù)各種多糖分子質(zhì)量的不同而將其分開。APS分離出AP1、AP2、AP3和AP4 4個(gè)組分,其中AP2和AP3是主要成分,二者都為均一多糖。AP2-a和AP3-b 2種組分純度較高,不含蛋白質(zhì)、多肽、核酸、糖醛酸、淀粉等雜質(zhì),不含還原糖、單糖和二糖,它們的物理性質(zhì)均為白色粉末,易溶于熱水,較難溶于冷水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇等有機(jī)溶劑,黏度較大,氣味清香,平均分子質(zhì)量分別為15 019和20 739 u,活性范圍在10 000~2 000 000 U,均屬活性多糖。AP2-a中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖及吡喃環(huán)結(jié)構(gòu),AP3-b中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖和D-鼠李糖及吡喃環(huán)結(jié)構(gòu),其中D-吡喃葡萄糖是與免疫、抗氧化和抗腫瘤等生物活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)。
植物多糖具有廣泛的生物活性,普遍具有免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]。免疫器官的發(fā)育狀況可直接影響機(jī)體免疫應(yīng)答水平、抵抗外來微生物感染和侵入的能力[6]。試驗(yàn)證明,APS能不同程度地促進(jìn)畜禽免疫器官胸腺、法氏囊、脾臟、盲腸、扁桃體的發(fā)育,延緩胸腺的萎縮[7],還能促進(jìn)肉雞腸道后段有益菌的生長,特別是乳酸菌,抑制埃希大腸桿菌的增殖,增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[8]。APS還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[9]。在體外APS能夠刺激植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和PWM培養(yǎng)液誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),說明APS有縮短細(xì)胞周期、顯著提高T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的作用,它還能增強(qiáng)由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫能力,對(duì)自然殺傷細(xì)胞(NK)的活化有影響[10]。另有試驗(yàn)證明,紅細(xì)胞通過其表面的C3b受體與抗原-抗體-補(bǔ)體免疫復(fù)合物(CIC)結(jié)合而發(fā)揮清除CIC和促進(jìn)吞噬的作用,增加紅細(xì)胞免疫功能,說明APS對(duì)雞紅細(xì)胞免疫功能具有繼發(fā)增強(qiáng)作用。APS還能糾正環(huán)磷酰胺對(duì)抗體形成細(xì)胞的抑制作用,在增強(qiáng)機(jī)體防御能力的同時(shí)快速消滅病原體,清除機(jī)體內(nèi)的衰老死亡細(xì)胞[11]。研究表明,APS可能通過抗原遞呈細(xì)胞(APCs)對(duì)抗惡性細(xì)胞或惡性細(xì)胞碎片,抗原肽在APCs上結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ或Ⅱ,MHCⅠ分子的抗原肽激活早期細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+),而MHCⅡ分子的抗原肽激活早期輔助性T細(xì)胞(CD4+),T輔助細(xì)胞1(Th1)產(chǎn)生細(xì)胞因子,包括白介素2(IL-2)和干擾素 γ(IFN-γ),這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的激活,激活NK和巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)產(chǎn)生(圖1)[12],所以 APS 可顯著促進(jìn)CD4+增殖和提高CD4+/CD8+,進(jìn)而起到免疫作用。APS還可提高機(jī)體的體液免疫功能,調(diào)節(jié)B細(xì)胞、CTL和M細(xì)胞等細(xì)胞功能,促進(jìn)免疫球蛋白(Ig)類抗體含量的提高,促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生和白介素2受體(IL-2R)的基因表達(dá),誘導(dǎo)白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子 α(TNF-α)的產(chǎn)生[13]。APS通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫力,減少應(yīng)激,把與病變相關(guān)的無效免疫應(yīng)答降到最低限度,從而使?fàn)I養(yǎng)成分被充分利用,這可能是APS改善動(dòng)物生長性能的機(jī)制之一[14]。
機(jī)體的代謝產(chǎn)生過多自由基會(huì)引起病變甚至死亡,但自身防護(hù)系統(tǒng)對(duì)自由基的清除能力有限[15],現(xiàn)被廣泛應(yīng)用的合成抗氧化劑因其毒性而減少使用,植物多糖作為一種天然抗氧化生物活性化合物而備受關(guān)注。APS作為一種自由基清除劑,除了與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),它還可以通過激活內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)起到間接保護(hù)的作用,可能有2種作用機(jī)制:第一,APS可能與自由基直接反應(yīng)來提高抗氧化酶活性;第二,APS可能會(huì)影響抗氧化酶的基因表達(dá),并調(diào)節(jié)特定酶的活動(dòng)[16]。1,1-二苯基 -2-苦基苯肼(1,1-dipheyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和羥自由基是2個(gè)最有代表性的自由基。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,抗氧化劑將電子或氫原子轉(zhuǎn)移到DPPH,從而消除了DPPH的自由基性質(zhì),抗氧化劑的抗氧化活性可通過對(duì)DPPH的抑制率表示,通過測(cè)試DPPH可以反映出自由基的清除程度。羥自由基是破壞性最強(qiáng)的自由基,它能通過所有需氧有機(jī)體形成和分解[17],會(huì)導(dǎo)致任何主要生物分子(如DNA、蛋白質(zhì)、脂類和小細(xì)胞)的氧化損傷,進(jìn)而導(dǎo)致心血管和神經(jīng)性疾病[18]。自由基生成引起老化是因?yàn)榛钚匝踝?reactive oxygen species,ROS)的增加和抗氧化防御的降低,前者主要是生物體正常細(xì)胞代謝的副產(chǎn)品,多產(chǎn)生于線粒體。ROS能引起脂質(zhì)過氧化、氨基酸殘基氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)形成DNA氧化損傷。正常生理?xiàng)l件下,ROS可以保護(hù)細(xì)胞的系統(tǒng)清除,但在某些病理?xiàng)l件下,ROS之間生成和消除動(dòng)態(tài)平衡可能被打破,導(dǎo)致細(xì)胞ROS水平增加,高水平的ROS可能在各種細(xì)胞成分中發(fā)生氧化損傷,并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。正常的生物體內(nèi)都有其抗氧化防御的清除氧化劑,來防止ROS對(duì)細(xì)胞的損傷。如超氧化物歧化酶(SOD)是一種在線粒體中含有的,對(duì)活性氧進(jìn)行有效防御的酶,它能通過超氧陰離子自由基加速過氧化氫的形成,清除氧自由基。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可將過氧化氫和過氧化物分解為無毒的產(chǎn)品,并通過細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物終止脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SOD和GSH-Px的內(nèi)源性抗氧化酶可以將ROS轉(zhuǎn)化成更少的有毒化合物,超氧化物先由SOD分解成過氧化氫,隨后通過一系列包括GSH-Px的活性酶催化和轉(zhuǎn)化變成水。丙二醛(MDA)可通過監(jiān)測(cè)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物反映自由基對(duì)組織細(xì)胞的損傷[20]。這些抗氧化酶能由脂質(zhì)過氧化物或自由基引起失活,從而導(dǎo)致其在氧化條件下通過各種條件誘導(dǎo)的毒性激活,ROS產(chǎn)量是評(píng)價(jià)活細(xì)胞的氧化損傷程度的直接指標(biāo)。研究表明,APS能清除ROS同時(shí)抑制自由基的產(chǎn)生[21],還能夠提高SOD、GSH-Px活性,減少M(fèi)DA的生成,進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力[22-24],保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞免受自由基攻擊,說明APS對(duì)機(jī)體有顯著的抗氧化作用,這也是它抗衰老、抗炎癥、降血脂、抗腫瘤等功效的藥理基礎(chǔ)[25]。在一定濃度下,APS清除DPPH及羥自由基的作用,隨濃度的增加而增強(qiáng),存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[26],但因淋巴細(xì)胞中存在對(duì)多糖的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,所以并非其濃度越高抗氧化作用越好。另外,不同植物多糖的抗氧化效果不同,可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)[27]。
圖1 苜蓿多糖的免疫應(yīng)答和作用方式流程圖Fig.1 Schematic representation of immune responses and actions of APS[12]
惡性腫瘤已成為威脅人類生存的主要疾病之一,多糖可進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),且無毒副作用。研究表明,多糖抗腫瘤的機(jī)制是通過刺激相關(guān)細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng),強(qiáng)化或活化相關(guān)免疫細(xì)胞,提高TNF-α、超氧化物離子和IL-2等細(xì)胞因子含量。多糖抗腫瘤是通過提高機(jī)體的特異性或非特異性免疫功能,增強(qiáng)寄主自身的免疫力而發(fā)揮作用的。由相關(guān)試驗(yàn)可知,APS抗腫瘤可能有3個(gè)主要作用機(jī)制(圖2):第一,通過抑制增加癌癥的免疫因子的產(chǎn)生或中和免疫因子提高宿主免疫力。第二,直接或通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生來激活免疫細(xì)胞。第三,直接作用于癌細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,MHCⅠ抗原的表達(dá)增強(qiáng)。這些機(jī)制是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的多糖抑制癌癥復(fù)發(fā)的理論依據(jù)。張東杰等[28]的試驗(yàn)說明APS在一定程度上抑制了荷瘤小鼠體重的增加,延長了其生存期,對(duì)腫瘤的治療有幫助。
機(jī)體的宿主細(xì)胞抗菌防御系統(tǒng)遭到破壞時(shí)可能被細(xì)菌感染,另外細(xì)菌也能通過在宿主上皮黏膜表面定植來感染健康細(xì)胞。許多細(xì)菌可與宿主細(xì)胞表面的糖類結(jié)合,稱為黏附。細(xì)菌主要以長絲狀菌毛結(jié)構(gòu)黏附宿主細(xì)胞,菌毛從細(xì)菌細(xì)胞表面呈輻射狀,許多細(xì)菌毒素也由單個(gè)蛋白質(zhì)亞基聚集而成,每個(gè)亞基包含1個(gè)或多個(gè)糖類結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。與細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似的糖類可通過競爭與宿主細(xì)胞結(jié)合而抑制細(xì)菌定植或黏膜上皮細(xì)胞中毒[29]。一般單個(gè)糖序列與蛋白質(zhì)結(jié)合能力很低,通過每個(gè)蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合點(diǎn)組成多聚體,可使糖類與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力顯著增加,這樣一種蛋白質(zhì)便可與同源寡聚多糖緊密結(jié)合。多糖抗感染就是通過多糖與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合,從而使細(xì)菌失去與宿主細(xì)胞結(jié)合的親和力,無法結(jié)合宿主細(xì)胞受體上的糖序列而抑制細(xì)菌感染的。
圖2 腫瘤微環(huán)境和苜蓿多糖的作用過程Fig.2 Tumor microenvironment and actions of APS[12]
圖3 細(xì)菌與宿主細(xì)胞表面結(jié)合Fig.3 The binding of microbes to cell surfaces of the host[29]
APS在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)畜禽有明顯的促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗感染的作用,對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞活化有免疫增強(qiáng)作用,APS還有降血脂、降血糖、降血壓、解毒、抗血栓、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗輻射、抗疲勞、抗衰老、抗蟲、化感等作用[30],另外APS還可治療高膽固醇,強(qiáng)化血管和預(yù)防動(dòng)脈硬化、心肌梗塞等。
APS可以提高畜禽抗病能力。郝永清等[10]用APS做肉仔雞疫苗佐劑進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示肉仔雞體內(nèi)抗體免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)水平提高,說明多糖可通過激活補(bǔ)體強(qiáng)化抗體作用,增強(qiáng)畜禽免疫功能,提高畜禽抗病能力。
APS可以促進(jìn)畜禽生長。夏素銀等[31]用肉仔雞進(jìn)行試驗(yàn),分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0、0.5%、1.0%和2.0%APS,結(jié)果顯示添加APS 1%組增重高于0組,而2%組低于0組,1%組效果最好。說明添加APS能夠促進(jìn)畜禽生長但存在劑量效應(yīng),適量添加APS可提高畜禽對(duì)飼糧的利用率,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;江振瑩等[32]試驗(yàn)肉仔雞不同生長階段的體重測(cè)定結(jié)果顯示,APS可以促進(jìn)畜禽生長,其中1%添加組效果最好。
APS可以促進(jìn)畜禽免疫器官的發(fā)育。郝永清等[33]分別將APS通過不同途徑對(duì)肉仔雞進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示APS可促進(jìn)肉仔雞胸腺、法氏囊、脾臟、盲腸和扁桃體發(fā)育,說明APS能夠促進(jìn)畜禽免疫器官的發(fā)育。
APS可以促進(jìn)畜禽淋巴細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。劉晴雪等[34]分別將不同濃度的APS加入體外培養(yǎng)肉仔雞淋巴細(xì)胞,測(cè)定其增殖變化,結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞的吸光度值(OD)隨APS濃度增加先增高后降低;同濃度APS對(duì)不同器官淋巴細(xì)胞刺激程度不同,外周血和脾臟淋巴細(xì)胞OD低于胸腺和法氏囊;APS對(duì)外周血、脾臟、法氏囊和胸腺的最佳刺激濃度分別為 20、8、15 和 15 μg/mL。說明APS可通過刺激淋巴細(xì)胞的增殖提高畜禽的抗病能力。江振瑩等[32]分別添加0、1% 、8%APS 對(duì)肉仔雞進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示APS能使雞血清中雞新城疫抗體滴度提高,促進(jìn)細(xì)胞吞噬和轉(zhuǎn)化能力,8%添加組效果最好。郝永清等[33]將APS分別用肌注(2.5、5 和 10 mg/只)、加入疫苗(2.5、5 和10 mg/只)、飼料添加劑(0、10和80 mg/kg)3種不同方式對(duì)肉仔雞進(jìn)行試驗(yàn),在不同生長階段檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞的增殖,結(jié)果顯示APS可促進(jìn)肉仔雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞吞噬功能,提高血清中雞新城疫的抗體滴度。APS肌注5 mg/只組與配伍疫苗10 mg/只組和8%飼糧中添加組促進(jìn)免疫器官發(fā)育效果最好。說明APS能增強(qiáng)畜禽的細(xì)胞免疫功能,提高畜禽抗病能力。章世元等[35]分別用15、20和50 μg/mL APS對(duì)肉仔雞進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示適量APS可提高T細(xì)胞OD,促進(jìn)肉仔雞淋巴細(xì)胞增殖,20 μg/mL時(shí)效果最好,說明APS可促進(jìn)畜禽淋巴細(xì)胞增殖,且存在劑量效應(yīng)(表 1)。
表1 APS在肉雞上的應(yīng)用效果Table1 Application effects of APS on broilers
張世軍等[36]將APS加入豬瘟兔化弱毒疫苗對(duì)仔豬進(jìn)行免疫和攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示試驗(yàn)組仔豬外周血液的B細(xì)胞含量和IgG水平提高,仔豬發(fā)熱比對(duì)照組晚,時(shí)間短,程度輕,對(duì)豬瘟強(qiáng)毒抵抗力增強(qiáng),比單一疫苗預(yù)防豬瘟效果好。說明APS可強(qiáng)化豬瘟疫苗免疫作用,且不會(huì)損害肝、心臟等臟器。
我國苜蓿資源豐富,APS的原料成本相對(duì)較低,無毒副作用,容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,因此倍受國內(nèi)外市場青睞。APS具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、降血脂、降血糖、解毒、抗菌、抗炎等作用,作為一種植物提取物,在一定劑量范圍內(nèi)增強(qiáng)畜禽免疫力,降低疾病死亡率,促進(jìn)動(dòng)物生長,有利于提高動(dòng)物繁殖與機(jī)體性能,現(xiàn)已在畜禽養(yǎng)殖中大量應(yīng)用。近年來隨著人們對(duì)食品安全、動(dòng)物營養(yǎng)等各個(gè)領(lǐng)域重視度的不斷提高,APS在相關(guān)領(lǐng)域的作用日益凸顯。隨著多糖制備、結(jié)構(gòu)、合成研究的不斷深入,其應(yīng)用市場將更加廣闊。但是苜蓿產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化仍然存在一定問題:產(chǎn)業(yè)化投資需求大;市場對(duì)產(chǎn)品的數(shù)量要求大;科研投入不足等。另外APS分離提純的程序復(fù)雜,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不好控制,結(jié)構(gòu)測(cè)定也尚無一種有效方法,因此APS在畜禽飼料中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究與探索。
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動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)2013年1期