劉 偉，汪偉偉，黃 軍，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院 1．細胞電生理研究室;2．生理學省級重點學科“啟明星小組”，安徽 蕪湖 241002)

人類的生命活動涉及生理活動和心理活動兩方面，這種心理生理活動的統(tǒng)一性，也表現(xiàn)在諸多心理生理障礙和心身性疾病中，如藥物成癮、創(chuàng)傷后應激障礙等。以藥物成癮為例，其既包括精神依賴(psychological dependence)也包括軀體依賴(physical dependence)。軀體依賴可以隨著各種戒毒方法的應用漸漸消退，但精神依賴卻可長久存在，導致成癮者再次使用成癮藥物(復吸)［1］。成癮中精神依賴和軀體依賴的關系尚不清楚，有學者認為精神依賴先出現(xiàn)，在反復的線索、獎賞誘導下才出現(xiàn)了軀體依賴;但也有人提出至少在煙草成癮中精神依賴和軀體依賴是平行發(fā)生的［2］。目前關于藥物成癮的研究既有心理角度的摸索也有生理方面的探究，但多為分別進行，僅偶見報道稱心理活動與生理活動的解偶聯(lián)(decoupling)可能是成癮機制之一［3］。同樣，創(chuàng)傷后應激障礙除了心理障礙外，通常也伴有神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能改變，并引發(fā)軀體癥狀。由此可見，藥物成癮等精神類疾病或心身疾病的研究，亟需一種心理生理學綜合技術來較系統(tǒng)地揭示其可能的發(fā)病機制。為此，我們以藥物成癮為例，選擇了與藥物成癮密切相關的腦內(nèi)獎賞和懲罰系統(tǒng)代表性核團進行同步細胞外記錄，并聯(lián)合多項生理指標記錄的技術，為進一步對藥物成癮的精神依賴和軀體依賴以及其他精神性疾病，從心理和生理兩方面同時進行實驗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 實驗動物 選用280～300 g成年SD大鼠26只，雌雄不拘，由南京青龍山動物繁殖場提供。

1．2 儀器設備及藥品 常規(guī)動物手術器械、雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩和防震臺、手術顯微鏡、腦立體定位儀、牙科鉆和保溫毯(上海奧爾科特生物科技有限公司)。不銹鋼同芯金屬電極、金屬參考電極和微電極放大器、PowerLab八通道生理信號采集與分析系統(tǒng)(AD Instruments，Australia)及其 Chart Pro記錄和分析軟件、20%烏拉坦等。

1．3 實驗方法

1．3．1 多項生理指標同步記錄 取大鼠用20%烏拉坦按1．5 g/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉穩(wěn)定后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，下墊保溫毯(設定溫度37．0℃)，放置在雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺上。將體溫換能器探頭置于大鼠肛門內(nèi)，進行體溫信號的采集。在大鼠右前肢用針式電極插入腕關節(jié)上部的前臂皮下，左后肢用針式電極插入踝關節(jié)上部的大腿皮下，右后肢接地，記錄標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。將2根針式電極插入大鼠右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌內(nèi)，記錄呼吸肌肌電圖。將2塊板式皮膚電導電極，用醫(yī)用膠布分別固定于大鼠左前肢掌面和背面，記錄皮膚電導。

1．3．2 腦深部雙核團細胞外記錄 頭部備皮。調(diào)節(jié)耳桿使之左右對稱，固定大鼠頭部使之不能移動。用手術刀切開頭皮，3%H2O2擦拭充分止血，暴露顱骨標志(前囟、人字縫)。調(diào)節(jié)前囟、人字縫到同一水平平面。定位腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA):前囟后(AP)－6．72 ～ －6．84 mm;右旁開(R)0．4 ～1．13 mm;硬膜表面以下(DV)7．5 mm～8．5 mm。定位基底外側(cè)杏仁核(BLA):AP －1．56 ～ －3．36 mm;左旁開(L)3．9 ～4．6 mm;DV 7．8 ～8．82 mm［4］。以牙科鉆鉆顱開窗，手術顯微鏡下用顯微剪剪開硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，3%H2O2充分止血。使用金屬電極在操作臂的牽引下移至顱窗上，并緊貼腦組織，2%鹽水瓊脂封窗。安置好參考電極、接地電極。記錄電極接入放大、記錄系統(tǒng)。操縱電極下至目標腦區(qū)后，微調(diào)電極尋找合適、明確的細胞外電活動信號。

1．3．3 信號采集參數(shù)設置 所采集的6通道信號，經(jīng)換能器或放大器放大，接入PowerLab多導生理信號采集與分析系統(tǒng)，由計算機中Chart Pro軟件進行采集、存盤，采樣頻率4 kHz。各通道參數(shù)設置如下:VTA、BLA電活動信號高通10 Hz、低通2 kHz，體溫信號低通10 Hz，心電信號高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌電信號高通 0．1 Hz、低通 200 Hz，皮膚電導信號量程設為10μS。

實驗結(jié)束，取腦于4%甲醛溶液內(nèi)固定或冰凍后，進行冠狀面切片，觀察針道位置與圖譜VTA、BLA的位置進行比對，進行記錄位點鑒定。

1．4 數(shù)據(jù)分析 記錄到的腦內(nèi)核團電活動信號，用Chart Pro軟件進行數(shù)據(jù)測量和分析，并作有關指標的相關性分析等。幅值為Chart Pro軟件從選定時間內(nèi)檢測的信號幅度最大值減去最小值，即信號的最大振幅值。呼吸肌肌電周期計算，使用Chart Pro軟件中周期測量(Cyclic measurements)功能，最小峰高S．D．設為5、濾波設為高通150 Hz、最小周期設為720 ms，將數(shù)據(jù)添加到數(shù)據(jù)板，可自動算出均數(shù)，即為平均肌電周期(代表呼吸頻率)。結(jié)果以ˉx±s表示。用 Origin 5．0軟件(Microcal Software Inc，USA)進行相關數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和作圖。P＜0．05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2．1 6通道同步記錄在對腦內(nèi)VTA、BLA核團電活動進行同步細胞外記錄的同時，監(jiān)測體溫、心電、呼吸肌(肋間外肌)肌電、皮膚電導等生理指標，1只大鼠典型的6通道同步記錄結(jié)果例示于圖1。

圖1 單只大鼠的6項心理生理學指標同步記錄A為常規(guī)顯示，從上到下依次為:VTA電活動(μV)、BLA電活動(μV)、體溫(℃)、心電(μV)、呼吸肌肌電(μV)，皮膚電導(μS)。B為A圖中相應生理指標(虛線框)的放大

圖2 VTA和BLA同步記錄的放電頻率直方圖(Bin=10 s)

2．2 VTA和BLA電活動特性及其相關性分析 放電頻率直方圖分析是細胞外記錄的主要分析方法，用以反映核團或神經(jīng)元電活動的頻率，進而了解核團電活動的特性。1只大鼠VTA和BLA電活動記錄的典型放電頻率直方圖分析例示于圖2。對26只大鼠各取穩(wěn)定記錄的VTA和BLA電信號20 min，用Chart Pro軟件檢測出平均頻率作為放電頻率值，結(jié)果顯示BLA的放電頻率(0．88±0．99)Hz高于 VTA(0．50 ±0．55)Hz，配對 t檢驗，P ＜0．01。進一步進行相關分析(圖3)，表明BLA放電頻率與 VTA放電頻率呈正相關(r=0．936，P＜0．01)。進一步對12只大鼠進行6個通道記錄指標的分析，亦顯示不僅BLA的放電頻率，其電活動的幅值也高于 VTA(P ＜0．01，表1)。

2．3 生理指標分析在12只大鼠進行6個通道記錄指標的分析中，同步記錄的4項生理指標是體溫、皮膚電導、心電圖和呼吸肌肌電圖。應用Chart Pro軟件對大鼠心電圖、肌電圖等生理指標進行分析，其呼吸肌肌電、體溫、皮膚電導和心電信號的基本測量結(jié)果列于表2。

圖3 大鼠VTA和BLA放電頻率的相關性分析

表1 大鼠VTA和BLA電活動檢測結(jié)果(n=12)

表2 大鼠呼吸肌肌電、體溫、皮膚電導、心電信號檢測結(jié)果(n=12)

2．4 VTA和BLA電活動與生理指標間的相關性應用本技術不僅可以分別對腦內(nèi)核團間的電活動進行相關性分析，同時還可以進行腦內(nèi)核團電活動與生理指標間的相關性分析。圖4例示了腦內(nèi)VTA和BLA電活動與生理指標的相關性記錄結(jié)果，圖中箭頭所指處先出現(xiàn)VTA和BLA電活動的明顯減弱，接著出現(xiàn)呼吸肌肌電活動的明顯增強，隨后1個間歇期延長，呈現(xiàn)1次呼氣后期的深吸氣過程，稱之為“自發(fā)深呼吸反應”，與實時觀察動物活動一致，并伴有明顯的皮膚電導反應。

為進一步分析上述現(xiàn)象，連續(xù)觀察穩(wěn)定信號，取自發(fā)深呼吸反應期2 s，其前對照期2 s，進行VTA和BLA核團電活動、心電、肌電、皮膚電導、體溫等指標同步變化情況的參數(shù)檢測和分析。由圖4可見，各指標的幅值檢測呈現(xiàn)反應期腦內(nèi)核團電活動首先減弱，隨即呼吸肌肌電活動增強，其后皮膚電導幅值增大。表3的數(shù)據(jù)分析表明，反應期的VTA電活動幅值減小(P＜0．05)，呼吸肌肌電幅值增大(P＜0．01)和皮膚電導幅值增大(P＜0．01)，同時 BLA電活動幅值有減小趨勢(P=0．07)。但心電指標的變化沒有顯著性意義(P＞0．05)。圖4的各指標變化時間順序，結(jié)合表3的數(shù)據(jù)分析，表明這種反應的發(fā)生可能是源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動的改變，繼而導致生理活動的變化。

圖4 腦內(nèi)VTA和BLA電活動改變引起的外周生理指標變化

表3 大鼠自發(fā)深呼吸反應期各指標的變化(ˉx±s，n=9)

2．5 傷害性刺激的影響 為檢測本技術能否反映外周傷害性刺激誘發(fā)的心理生理反應，記錄過程中使用充分絕緣后的血管鉗夾持大鼠尾巴后1/3處(夾尾刺激)作為傷害性刺激，強度以后肢抽動為適宜強度。以夾尾刺激前各指標信號為基礎水平(100%)，對夾尾時、夾尾后信號作歸一化處理，再進行統(tǒng)計學分析(n=12)。

由圖5可知，與基礎水平相比VTA放電頻率在夾尾時比夾尾前顯著性降低(P＜0．001)，夾尾后比夾尾前顯著性升高(P＜0．05)。BLA放電頻率在夾尾刺激時降低(P＜0．05)，刺激停止后發(fā)放頻率恢復并有超過基礎水平的趨勢。

圖5 夾尾刺激誘發(fā)的VTA和BLA放電頻率變化

對夾尾刺激過程中的BLA和VTA電活動幅值進行分析顯示(圖6)，夾尾時BLA和VTA電活動幅值相比夾尾前均下降(VTA:P＜0．001，BLA:P＜0．01)，夾尾刺激結(jié)束后BLA和VTA電活動幅值都回升(VTA:P ＜0．001，BLA:P ＜0．01)。

圖6 夾尾刺激誘發(fā)VTA和BLA電活動幅值的變化

同時，對夾尾刺激誘發(fā)生理指標的變化進行分析顯示(圖7)，心電信號RR間期與夾尾前相比在夾尾時顯著性縮短(P＜0．01)，刺激結(jié)束后雖然有所恢復，但仍短于夾尾前(P＜0．05)。呼吸肌肌電幅值在夾尾時僅有升高的趨勢(配對t檢驗，P=0．11)，夾尾后比夾尾前降低(P ＜0．001)。其他指標如R波幅值、皮膚電導幅值(數(shù)據(jù)未顯示)等的變化均沒有顯著性意義。

圖7 夾尾刺激誘發(fā)RR間期、呼吸肌肌電幅值的變化

3 討論

基于心理活動與生理活動相統(tǒng)一的心理生理學觀點，以及利用多導生理記錄儀記錄皮膚電導、心率、脈搏、心電、呼吸、面部肌電和腦電等信號來進行人的情緒評估等心理生理學技術［5］，本文報道了在麻醉大鼠進行腦內(nèi)雙核團細胞外記錄和多導生理指標同步記錄的技術，其中腦內(nèi)核團選擇了與藥物成癮密切相關的腦內(nèi)獎賞系統(tǒng)與懲罰系統(tǒng)代表性核團VTA和BLA電活動為例，與多項生理指標的活動觀察相結(jié)合，進行相互關系的分析，結(jié)果表明是一種可行的綜合性心理生理學研究技術。

實驗結(jié)果顯示本方法可以較好地同步記錄腦內(nèi)VTA與BLA雙核團電活動和多項生理活動信號，并對這些信號進行系統(tǒng)地分析(如心電、肌電)，也可以做與其他信號之間的相關性分析。在實驗中，沒有使用傳統(tǒng)有創(chuàng)的氣管插管法和膈肌肌電活動評估呼吸功能的做法，而是改進了文獻報道的“打開腹腔從腋前線第9肋骨下緣刺入電極，不會穿透胸膜傷及肺”的操作［6］，直接將電極經(jīng)皮插入相應位置，記錄肋間肌肌電活動。本文所檢測到肋間肌肌電頻率與同等條件下大鼠呼吸頻率相符，各項指標均與相關報道基本一致［7－11］。

本文還觀察到大鼠的自發(fā)深呼吸反應現(xiàn)象。從記錄結(jié)果看，先出現(xiàn)腦內(nèi)核團電活動改變，繼而呼吸肌肌電幅值升高、皮膚電導幅值增大。從各指標變化時間順序來看，可能是VTA和BLA核團電活動的改變導致了外周生理活動反應，這無疑為本技術作為心理生理學動物實驗方法的建立提供了支持。從自發(fā)深呼吸反應的現(xiàn)象看，推測可能是中樞缺氧導致的腦內(nèi)神經(jīng)活動受到抑制，進而誘發(fā)一次深呼吸反應。不過，本文尚未能對該現(xiàn)象的機制和意義進行分析，有待于進一步的研究。此外，傷害性夾尾刺激誘發(fā)的反應則是由外周刺激引發(fā)的腦內(nèi)活動改變和生理活動變化，而VTA和BLA核團與傷害性刺激引起的痛覺反應也密切相關，故以此了解本實驗技術對外周刺激誘發(fā)反應的監(jiān)測情況。結(jié)果顯示VTA和BLA電活動都在夾尾時受到抑制，夾尾后恢復并超過原來基礎水平，但不同核團對刺激的響應程度不同。與此類似，不同的生理信號對夾尾刺激的反應也不同，心電RR間期在夾尾時減小，夾尾后逐漸升高，呼吸肌肌電幅值則在夾尾時有升高趨勢，夾尾后降低，顯示了傷害性夾尾刺激可引起一定特異性生理反應。以上結(jié)果說明，本文所建立的大鼠腦內(nèi)雙核團細胞外記錄與多項生理指標聯(lián)合記錄的心理生理學實驗技術，既可以檢測由腦內(nèi)活動變化引發(fā)的外周生理活動改變，也可以反映外周刺激誘發(fā)的中樞及外周生理活動變化。

本實驗表明，該實驗方法的特點表現(xiàn)在一方面可以在活體動物上同時對兩處深部核團進行細胞外電信號記錄，進而在整體條件下進行相關功能核團間的相互作用分析，以藥物成癮研究為例，就可以進行腦內(nèi)獎賞和懲罰系統(tǒng)相關核團功能聯(lián)系和相互影響的分析。另一方面可以實現(xiàn)多項生理指標同步記錄，不僅可以了解腦內(nèi)功能活動對外周生理功能的影響，而且能通過多項生理功能的比較分析其反應模式的特異性，實現(xiàn)心理生理學研究的目標。以藥物成癮研究為例，不僅大鼠藥物成癮出現(xiàn)戒斷反應的體征［12］可反映在所檢測的生理指標變化上，同時有關“心理-渴求偶聯(lián)”在成癮者中會發(fā)生改變［13］的特征亦可得到觀察，故能較為全面地分析藥物成癮軀體依賴導致的生理指標變化。由此可見，該實驗技術是從心理學和生理學交叉技術的角度，聯(lián)合分析心理生理指標，為藥物成癮等心身疾病機制的綜合性研究提供了一種實用的技術。

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