李 文， 李民贊， 孫 明

(1.北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，北京 100048;

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代精細(xì)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

菠菜中樂(lè)果農(nóng)藥殘留的比色法測(cè)定條件研究

李 文1， 李民贊2， 孫 明2

(1.北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，北京 100048;

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代精細(xì)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

為研究菠菜中樂(lè)果農(nóng)藥殘留的快速安全檢測(cè)方法，根據(jù)樂(lè)果在堿性(NaOH)溶液中分解，生成物Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)生成洋紅色產(chǎn)物的原理，對(duì)比色條件進(jìn)行了研究和優(yōu)化.詳細(xì)分析并驗(yàn)證了顯色體系的配制方法，確定了顯色體系的較佳參數(shù)值:pH值為5.7，溫度為24℃，反應(yīng)時(shí)間為20 s.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳比色條件下在390 nm處有明顯的特征吸收峰，可以測(cè)定1×10－6的樂(lè)果農(nóng)藥殘留.用最小二乘法建立了菠菜中樂(lè)果農(nóng)藥殘留的數(shù)學(xué)模型，相關(guān)系數(shù)R2=0.941 5，樣品回收率為91.6%～108.9%，為以后開(kāi)發(fā)便攜式農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀器的光源提供了依據(jù).

樂(lè)果農(nóng)藥殘留;比色法;光譜分析

樂(lè)果屬于我國(guó)常用的有機(jī)磷農(nóng)藥之一，除作為內(nèi)吸劑外，也有較強(qiáng)的觸殺作用，常用于防治蔬菜、果樹(shù)、茶、桑、糧食作物的多種害蟲(chóng)和葉螨.殘留在水果和蔬菜上的有機(jī)磷或環(huán)境中的有機(jī)磷進(jìn)入到有機(jī)體內(nèi)，大部分會(huì)對(duì)生物體內(nèi)膽堿酯酶有抑制作用，使其失去分解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿積累，引起神經(jīng)功能紊亂，從而導(dǎo)致肌體的損害［1－3］.現(xiàn)在對(duì)果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)比較成熟的方法有波譜法、色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法等，這些檢測(cè)方法步驟復(fù)雜，所用時(shí)間長(zhǎng)，且儀器昂貴，難以普及［4－7］.酶抑制法、免疫分析法、光譜技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和生物芯片技術(shù)等快速檢測(cè)技術(shù)也都有其不足之處［8－19］.試劑比色法(簡(jiǎn)稱比色法)是通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的一種常規(guī)檢測(cè)方法，單獨(dú)使用比色法只能檢測(cè)微量元素［20］，無(wú)法滿足 GB2763—2005規(guī)定的樂(lè)果在葉菜中的最大殘留限量1×10－6.本文把傳統(tǒng)的試劑比色法和光譜分析技術(shù)相結(jié)合，由于樂(lè)果可以和幾種試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，從安全、經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選用亞硝酰鐵氰化鈉作為顯色劑，利用分光光度計(jì)測(cè)定顯色反應(yīng)后溶液的吸光度，滿足了檢測(cè)要求.但是亞硝酰鐵氰化鈉的水溶液不穩(wěn)定，顯色試劑的配制和顯色反應(yīng)的效果受到較多因素的影響，吸光度曲線受干擾較大.本文分析并確立了亞硝酰鐵氰化鈉溶液的較佳配制方法和條件，明確了樂(lè)果農(nóng)藥的殘留濃度和光譜的吸光度值成正相關(guān)的線性關(guān)系.利用最小二乘法建立了該種農(nóng)藥的含量標(biāo)準(zhǔn)模型，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)便攜式在線檢測(cè)儀器的光源提供了可行的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 比色試劑的選用

樂(lè)果(Rogor)分子式為 C5H12NO3PS2，化學(xué)名O，O-二甲基-S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯.和樂(lè)果可以發(fā)生顯色反應(yīng)的試劑有多種，如樂(lè)果溶液和硝酸銀可生成黃色沉淀物;樂(lè)果水解時(shí)釋放出甲胺，甲胺和2，4-二硝基氯苯反應(yīng)可生成黃色產(chǎn)物;由于樂(lè)果中含有硫，可以和氯化鈀反應(yīng)得到黃色產(chǎn)物;樂(lè)果在酸性溶液中較穩(wěn)定，在堿性溶液中迅速水解成硫代磷酸和硫醇，硫化物和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)生成洋紅色化合物等.考慮到比色試劑的安全性和經(jīng)濟(jì)性，本研究選用亞硝酰鐵氰化鈉作為比色試劑，亞硝酰鐵氰化鈉分子式為Na2［Fe(CN)5NO］，易溶于水，微溶于醇，低毒，價(jià)格低廉，易于購(gòu)買(mǎi)和儲(chǔ)存.樂(lè)果在NaOH溶液中分解出Na2S，Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉的化學(xué)反應(yīng)式為:

其生成物為洋紅色.

1.2 材料與試劑

40%的樂(lè)果乳油農(nóng)藥，北京嘉禾種業(yè)有限公司;去離子水、質(zhì)量濃度為600 g/L的NaOH溶液、亞硝酰鐵氰化鈉晶體、乙醇(分析純)，北京藍(lán)弋化工公司.用去離子水分別配置 1 ×10－6，2 ×10－6，4 ×10－6，8 ×10－6，16 ×10－6的樂(lè)果溶液.每種溶液取10 mL，分別滴入質(zhì)量濃度為600 g/L的NaOH溶液0.5 mL進(jìn)行分解.由于亞硝酰鐵氰化鈉的水溶液不穩(wěn)定，分解之后由褐色變?yōu)樗{(lán)色，所以該試劑需要臨時(shí)配置.取0.5 g亞硝酰鐵氰化鈉溶于50 mL去離子水中，搖勻后取2 mL亞硝酰鐵氰化鈉溶液和上述樂(lè)果NaOH溶液混合，在反應(yīng)溫度約為24℃的情況下放置20 s，即刻放入比色皿中用分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)試.對(duì)每一濃度在300～900 nm波段分別采集顯色反應(yīng)前和顯色反應(yīng)后的吸光度譜圖.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及分析軟件

UV－2450型紫外/可見(jiàn)/分光光度計(jì)，日本島津集團(tuán)，分辨率0.1 nm，可用于各種有機(jī)、無(wú)機(jī)固體或液體的光學(xué)特性.該儀器具有測(cè)量速度快、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，選定測(cè)量波長(zhǎng)范圍300～900 nm.采集的數(shù)據(jù)上傳至計(jì)算機(jī)，利用軟件UVPRO進(jìn)行光譜預(yù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的樂(lè)果農(nóng)藥沒(méi)有加入NaOH溶液和亞硝酰鐵氰化鈉的光譜圖見(jiàn)圖1.可以看出，光譜的吸光度值和農(nóng)藥濃度沒(méi)有明顯關(guān)系.反應(yīng)溫度24℃，顯色反應(yīng)20 s的條件下不同濃度樂(lè)果在顯色反應(yīng)預(yù)處理后的光譜圖見(jiàn)圖2，可以看出其光譜的走勢(shì)相同，吸光度值和農(nóng)藥的濃度成正相關(guān)的關(guān)系，即可以利用吸收光譜的吸光度值反映樂(lè)果農(nóng)藥的濃度，且在390 nm處有最大吸收峰，根據(jù)比色測(cè)定原理，確定敏感波長(zhǎng)為λmax=390 nm.

圖1 不同濃度樂(lè)果農(nóng)藥未發(fā)生顯色反應(yīng)的吸光度譜圖Fig.1 Absorbance of different concentration rigor pesticide without coloring reaction

圖2 不同濃度樂(lè)果農(nóng)藥和亞硝酰鐵氰化鈉發(fā)生顯色反應(yīng)后的吸光度譜圖Fig.2 Absorbance of different concentration rigor pesticide after coloring reaction

2.2 顯色體系中pH值的確定

實(shí)驗(yàn)證明，顯色反應(yīng)的效果對(duì)獲取光譜的吸光度值梯度影響很大.顯色反應(yīng)的效果和反應(yīng)時(shí)間、溫度、加入NaOH溶液的量以及加入的亞硝酰鐵氰化鈉的量有很大關(guān)系.加NaOH溶液過(guò)多時(shí)，過(guò)量的NaOH和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)，生成黃色化合物;加NaOH太少時(shí)，生成的Na2S太少，Na2S和亞硝酰鐵氰化鈉反應(yīng)不明顯，因此對(duì)不同含量的樂(lè)果溶液，如何保證加入適量的NaOH非常必要.由于實(shí)際檢測(cè)時(shí)不知道菠菜中所含樂(lè)果的殘留量，無(wú)法根據(jù)化學(xué)方程式進(jìn)行理論計(jì)算，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用pH計(jì)實(shí)時(shí)測(cè)試反應(yīng)溶液的pH值是一個(gè)好的方法.在保證溫度和反應(yīng)時(shí)間都一樣的情況下，對(duì)上述5個(gè)濃度的樂(lè)果溶液分別依次改變滴入NaOH溶液的量，同時(shí)測(cè)定溶液中的pH值和390 nm處的吸光度，發(fā)現(xiàn)pH值接近于5.7時(shí)吸光度最大，分析認(rèn)為當(dāng)樂(lè)果和NaOH恰好完全反應(yīng)時(shí)，因溶液中有含羥基的化合物，呈酸性，與實(shí)驗(yàn)測(cè)試相符.

2.3 顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度的確定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高時(shí)，溶液呈藍(lán)色或藍(lán)綠色，不能得到洋紅色化合物;時(shí)間過(guò)短或溫度過(guò)低，反應(yīng)不完全，洋紅色現(xiàn)象不明顯.對(duì)16×10－6的樂(lè)果顯色反應(yīng)預(yù)處理后，在溫度范圍16～46℃(每隔1℃測(cè)試一次)，對(duì)每一個(gè)溫度下的溶液在10～120 s內(nèi)(每隔5 s測(cè)試一次)進(jìn)行390 nm處吸光度的測(cè)試.測(cè)試結(jié)果顯示，在溫度為23～25℃、時(shí)間為20～25 s時(shí)，吸光度A的值最大，約為0.59.同時(shí)發(fā)現(xiàn)在保持溫度不變時(shí)，吸光度隨著反應(yīng)時(shí)間的不同有所變動(dòng)，在反應(yīng)時(shí)間一定的情況下，吸光度隨著溫度的改變也有所變化，見(jiàn)圖3.圖3(a)為在溫度保持24℃時(shí)放置時(shí)間和吸光度A的關(guān)系.圖3(b)為反應(yīng)時(shí)間為20 s時(shí)溫度和吸光度A的關(guān)系.

圖3 溫度和時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)后溶液吸光度的影響Fig.3 Effects of temperature and time on solution absorbance after coloring reaction

對(duì)其他濃度(1 × 10－6，2 × 10－6，4 × 10－6，8 ×10－6)的樂(lè)果溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)預(yù)處理后做同樣的實(shí)驗(yàn)，最佳溫度和時(shí)間變化不大，所以將該顯色反應(yīng)的較佳時(shí)間確定為20 s，較佳溫度為24℃.

2.4 其他因素的影響

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于亞硝酰鐵氰化鈉二水化合物是鮮紅色透明晶體，其水溶液不穩(wěn)定，一定時(shí)間后由褐色變成藍(lán)色，對(duì)顯色反應(yīng)有顏色上的干擾，但是臨時(shí)配置亞硝酰鐵氰化鈉溶液，在反應(yīng)時(shí)間為20 s時(shí)，這一因素的影響可以不計(jì).實(shí)驗(yàn)證明用1.2所述配置方案，所用亞硝酰鐵氰化鈉的量對(duì)(0～16)×10－6的樂(lè)果的顯色效果沒(méi)有明顯差異，且效果較好.若加入的亞硝酰鐵氰化鈉的量比其少時(shí)，會(huì)反應(yīng)不完全;加入的量過(guò)多又會(huì)使正常色澤受影響，在390 nm處的吸光度值都會(huì)降低.實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，若用乙醇配置一定濃度的樂(lè)果溶液時(shí)，較多的乙醇存在對(duì)顯色反應(yīng)也有干擾，使其吸光度降低，因此實(shí)驗(yàn)中用去離子水對(duì)樂(lè)果進(jìn)行濃度配置.

2.5 光譜預(yù)處理

利用軟件UVPRO可對(duì)原始譜圖有效消除因系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差引起的光譜測(cè)量數(shù)據(jù)的噪聲，可能存在各隨機(jī)因素引起的光譜信號(hào)基線漂移和基線旋轉(zhuǎn).為了從復(fù)雜、重疊、變動(dòng)的背景中提取光譜有用信號(hào)，獲取高信噪比、低背景干擾的分析信號(hào)，研究分別采用了基線校正、平滑和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理方法對(duì)所得到的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的預(yù)處理.

2.6 最小二乘法建立數(shù)學(xué)模型

在λmax=390 nm處利用最小二乘法建立一元回歸模型，相關(guān)系數(shù)R2=0.941 5，具有較好的線性關(guān)系，如圖4.可以看出，在樂(lè)果濃度較高時(shí)，線性相關(guān)性較好，在樂(lè)果濃度低時(shí)，線性相關(guān)性較差.

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

配置濃度為 16 × 10－6，8 × 10－6，4 × 10－6，2 ×10－6及1×10－6的樂(lè)果溶液各1組，每組取10 mL均勻噴灑在5顆無(wú)公害菠菜葉子上，晾干待用.取5組噴灑有不同濃度毒死蜱溶液的油菜樣品各10 g，將其切碎并和乙醇混合并超聲攪拌60 min，取上清液，并用過(guò)濾紙過(guò)濾.提取和過(guò)濾兩次，過(guò)濾液用10 mL乙醇漂洗，濃縮、干燥后，用蒸餾水溶解并定容到5 mL.對(duì)5組樣品分別按照1.2的步驟進(jìn)行預(yù)處理后，測(cè)試其吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為分析用數(shù)據(jù).樣品的加標(biāo)回收率分析結(jié)果如表1(其中加標(biāo)回收率是指在空白的樣品無(wú)公害菠菜中加入定量的檢測(cè)物質(zhì)樂(lè)果，然后用檢測(cè)量除以添加量.n是重復(fù)的次數(shù)).結(jié)果表明，樂(lè)果農(nóng)藥的加入量和回收量基本相符，回收率為91.6% ～108.9%.

表1 無(wú)公害菠菜的樣品回收率Tab.1 Sample recovery percent of pollution-free spinach

4 結(jié)論

本文從安全經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，選用亞硝酰鐵氰化鈉作為顯色劑，但是其顯色體系的影響因素較多，除了反應(yīng)時(shí)間和溫度外，樂(lè)果、NaOH及亞硝酰鐵氰化鈉3種反應(yīng)物的量也很關(guān)鍵.通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定了顯色試劑的配置方法，明確了顯色體系的較佳pH值、反應(yīng)時(shí)間和溫度.按照上述配置方法獲得的吸光度譜圖在390 nm處可以測(cè)定1×10－6的樂(lè)果濃度，為探索快速、安全地檢測(cè)樂(lè)果農(nóng)藥殘留方法提供了有益的參考.但是從一元回歸線性模型可以看出，在樂(lè)果濃度較低時(shí)，其線性相關(guān)性較差，分析為實(shí)驗(yàn)條件所限引起的誤差，可以繼續(xù)改進(jìn)試驗(yàn)方法，提高其線性相關(guān)度.

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Study on Colorimetry Determination Conditions of Rogor Pesticide Residues in Spinage

LI Wen1， LI Min-zan2， SUN Ming2
(1.College of Computer Science and Information Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing100048，China;2.Key Laboratory of Modern Precision Agriculture System Integration Research of Ministry of Education，China Agricultural University，Beijing100083，China)

In order to research the fast and safe determination method of Rogor pesticide residues in spinage，the colorimetric reaction conditions were researched and optimized in this study according to the principle that Nitrosyl iron sodium cyanide can produce carmine product by reacting with Na2S produced from the reaction between Rogor and NaOH solution.The experiment results showed that under the optimum coloring conditions 1 ×10－6Rogor pesticide could be detected at 390 nm absorption wavelength.The configuration method of the colorimetric system was analyzed and the optimum conditions were pH 5.7，suitable coloration temperature 24℃，and reaction time 20 s.The mathematical model was built by the least square method.The correlation coefficient was 0.941 5 and the sample recovery percent was 91.6% ～108.9%，which provide the feasible basis for developing light source of portable pesticide residues detecting instrument.

Rogor pesticide residues;colorimetry;spectrum analysis

TS255;TS207.5

A

2095-6002(2013)06-0058-05

李文，李民贊，孫明.菠菜中樂(lè)果農(nóng)藥殘留的比色法測(cè)定條件研究.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，31(6):58－62.

LI Wen，LI Min-zan，SUN Ming.Study on Colorimetry Determination Conditions of Rogor Pesticide Residues in Spinage.Journal of Food Science and Technology，2013，31(6):58 －62.

2013-01-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201003008).

李 文，女，副教授，碩士，主要從事光譜技術(shù)檢測(cè)和食品安全性方面的研究.

(責(zé)任編輯:檀彩蓮)